PLA-CS納米粒介導(dǎo)Survivin反義寡核苷酸增強阿霉素誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的體外研究.pdf

1、目的:肝癌(HCC)，是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高、預(yù)后差，嚴重威脅著人類生命與健康。目前，手術(shù)切除仍是治療肝癌首選和較有效的方法?；熓歉伟┮豁椫匾妮o助治療手段，但對正常細胞的毒性和腫瘤細胞的耐藥性是化療面臨的兩大難題。研究表明，Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，并具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞周期雙重功能，與腫瘤的化療耐藥性密切相關(guān)。納米顆粒基因轉(zhuǎn)運體是近年發(fā)展起來的一種新型的安全、有效并具有優(yōu)良特性的非病毒基

2、因轉(zhuǎn)運載體。本研究：1．制備聚乳酸殼聚糖納米粒，分析其性質(zhì)和體外轉(zhuǎn)染效率；2．利用新型的活細胞檢測技術(shù)分子信標直接檢測并證實人肝癌細胞系Be17402高表達Survivin；3．利用聚乳酸殼聚糖納米粒介導(dǎo)Survivin反義寡核苷酸研究增強阿霉素誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。 方法: 1．采用乳化溶劑揮發(fā)法，優(yōu)化工藝條件，成功制備粒徑較小、分布均勻的PLA-CS納米顆粒，用Malvern Zetasizer 3000E(UK)檢測P

3、LA-CS納米粒和PLA-CS/DNA復(fù)合物的Zeta電位以及粒徑分布。使用原子力顯微鏡(Asylum Research MFP-3D AFMSystems)來檢測PLA-CS納米粒粒徑大小和形態(tài)。然后利用電泳的方法觀察PLA-CS NP與DNA的結(jié)合情況和對DNA的保護，MTT實驗和流式細胞儀檢測PLA-CS NP在體外細胞轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性； 2．針對Survivin設(shè)計的分子信標通過PLA-CS納米粒介導(dǎo)入正常肝細胞系HL

4、7702細胞和肝癌細胞系Bel7402中，檢測Survivin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差別，臺盼蘭實驗檢測分子信標對細胞的生長情況的影響，RT-PCR證實分子信標檢測的準確性； 3．通過PLA-CS納米粒轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸進入肝癌細胞，運用RT-PCR和Western blot檢測Survivin的變化，MTT檢測細胞的增殖抑制，流式細胞儀檢測肝癌細胞的凋亡率。用阿霉素處理后，MTT檢測細胞的增殖抑制，流式細胞儀和AO/EB染色

5、觀測細胞的凋亡指數(shù)的變化。 結(jié)論: 1．成功制備平均粒徑87nm、分布均勻的PLA-CS納米顆粒。用殼聚糖修飾該納米顆粒表面，使其帶正電荷從而可逆的結(jié)合質(zhì)粒DNA，組裝成PLA-CS納米顆?；蜣D(zhuǎn)運體系，并對細胞生長毒性低。轉(zhuǎn)染效率較高。 2．利用分子信標建立了一種能在單細胞水平上檢測活體細胞中基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，有望發(fā)展成為一種能早期檢測腫瘤標志物的方法。 3．采用PLA-CS納米基因載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染針對S

6、urvivin設(shè)計的ASODN，轉(zhuǎn)染效率較高，ASODN發(fā)揮了高效的封閉作用，PLA-CS納米基因載體是一種安全，高效的新型的納米基因載體。采用PLA-CS納米基因載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SurvivinASODN，能有效的封閉Survivin基因，下調(diào)Survivin蛋白及mRNA的表達，并促進Bel7402細胞的凋亡。采用ASODN封閉Survivin的表達確實有效地抑制肝癌細胞的生長，增加細胞的凋亡。從而增加ADM的化療敏感性，改善常規(guī)化療的