端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及化療藥物對(duì)其活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言:肝細(xì)胞肝癌(HCC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，和其它惡性腫瘤相同，肝癌的形成是一種多因素、多階段、長(zhǎng)期相互作用過(guò)程，在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，分子生物學(xué)事件的復(fù)雜性日益受到人們的重視。人們通過(guò)研究證明，肝細(xì)胞腫瘤的重要生物學(xué)特性是細(xì)胞獲得了永生化，獲得永生化的重要原因之一在于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的激活，故而如何降低或完全去除hTERT活性從而逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性，日益成為實(shí)驗(yàn)研究的焦點(diǎn)。 端粒是真核生物染色體末端的一種保護(hù)性

2、結(jié)構(gòu)，正常體細(xì)胞由于末端復(fù)制，端粒隨細(xì)胞分裂而進(jìn)行性縮短，端粒酶能以自身作為模板合成端粒以彌補(bǔ)復(fù)制造成的端?？s短。由于正常人體細(xì)胞無(wú)端粒酶活性，細(xì)胞每分裂1次端?？s短序列約50～200bp，細(xì)胞經(jīng)若干分裂周期后，端粒縮短至臨界長(zhǎng)度，細(xì)胞即凋亡。但癌細(xì)胞由于端粒酶的激活使染色體端粒維持在一定長(zhǎng)度，得以永生和無(wú)限增殖。人端粒酶是由RNA和蛋白組成，它包括3個(gè)主要成分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNA(humantelomeraseRNA，HTR)，端

3、粒酶相關(guān)蛋白(telomeraseprotein，TP)，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)。研究表明，人端粒酶蛋白亞單位hTERT為端粒酶活性的必需和限速成分，其水平?jīng)Q定細(xì)胞端粒酶的活性，是端粒酶活性的關(guān)鍵因素。hTERT是個(gè)單拷貝基因，定位于5p15.33，約40kb。包含有7個(gè)保守序列區(qū)，16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，其蛋白質(zhì)由1132個(gè)氨基酸殘基組成。由于端粒酶逆轉(zhuǎn)

4、錄酶hTERT在大多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達(dá)，許多學(xué)者提出把抑制hTERT活性作為治療腫瘤的一種新方法?，F(xiàn)已證實(shí)，hTERT在體內(nèi)外可被肽核酸、促分化劑、反義寡核苷酸等抑制，其中反義寡核苷酸的研究很多。 反義(antisense)的概念1967年即被提出，1978年哈佛醫(yī)學(xué)院Zamecnik等首次報(bào)道反義寡核苷酸(antisenseoligodeo-xyfibonuleotide，AS-ODN)可抑制雞肉瘤病毒的復(fù)制。20年來(lái)，大量

5、研究證實(shí)了AS-ODN特異性抑制基因表達(dá)的能力，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到其在疾病治療方面的巨大潛能。其基本原理是根據(jù)核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原理而設(shè)計(jì)、合成與靶基因特定區(qū)域的DNA或RNA堿基序列互補(bǔ)的短核苷酸片斷，即寡核苷酸；它可與特定mRNA結(jié)合，阻斷mRNA翻譯，調(diào)節(jié)由基因到蛋白質(zhì)的信息傳遞，抑制靶蛋白質(zhì)表達(dá)。針對(duì)癌基因、生長(zhǎng)因子及其受體、信號(hào)傳導(dǎo)通路分子等設(shè)計(jì)的AS-ODN已作為一種新的工具廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外生物進(jìn)程機(jī)制的研究和作為一種有希望的藥

6、物用于治療，如癌癥、病毒感染等疾病，引起人們的極大興趣。hTERT反義寡核苷酸是以編碼反義的RNA，作用于hTERTmRNA成份，導(dǎo)致細(xì)胞增生危機(jī)從而死亡。 本研究擬在運(yùn)用免疫組化(SP法)和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)同步檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌組織中hTERT蛋白及hTERTmRNA的表達(dá)情況基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討人類端粒酶催化亞單位(hTERT)基因關(guān)鍵區(qū)段的反義寡核苷酸(as-hTERT)對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞周

7、期的影響，并選擇臨床常用化療藥物，觀察化療藥物對(duì)端粒酶、hTERT的調(diào)節(jié)作用，及其與細(xì)胞凋亡的聯(lián)系，從而為肝癌的治療奠定相關(guān)的實(shí)驗(yàn)、理論基礎(chǔ)。 第一部分:人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其意義 目的:研究hTERT基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)，探討其在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。 方法:應(yīng)用免疫組化(SP法)和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)同步檢測(cè)62例肝細(xì)胞肝癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中hTERT蛋白

8、及hTERTmRNA的表達(dá)情況，分析hTERT基因的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果:hTERT蛋白主要定位于肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，偶見核內(nèi)染色。hTERT蛋白和hTERTmRNA在肝細(xì)胞肝癌中的陽(yáng)性率分別為88.71％、82.26％，分別明顯高于癌旁肝組織的陽(yáng)性率9.68％、6.45％，差異具有顯著性(P＜0.01)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，肝細(xì)胞肝癌中的hTERT基因表達(dá)與腫瘤分級(jí)、門靜脈有無(wú)癌栓、血清中甲胎蛋白表達(dá)水平、是否合

9、并HBV感染等有關(guān)(P＜0.05)。 結(jié)論:hTERT基因可能在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其表達(dá)有望成為肝細(xì)胞肝癌的重要分子生物學(xué)指標(biāo)。 第二部:分端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡核苷酸(ASODN)下調(diào)端粒酶活性及其阻抑肝癌HepG2細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討人類端粒酶催化亞單位(hTERT)基因關(guān)鍵區(qū)段的反義寡核苷酸(as-hTERT)對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞周期的影響。 方法:通過(guò)PCR合

10、成as-hTERT、正義-hTERT序列，體外作用于HepG2細(xì)胞，TRAP法檢測(cè)正、反義核酸作用后的端粒酶活性變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察as-hTERT對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果:as-hTERT作用濃度為10μmol/L時(shí)，肝癌細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性明顯減低，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，細(xì)胞凋亡率增至16.02±2.11％。 結(jié)論:應(yīng)用針對(duì)as-hTERT的反義技術(shù)在體外可通過(guò)下調(diào)hTERT基因表達(dá)，明顯降低肝癌細(xì)胞HepG2

11、的端粒酶活性，并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，hTERT可望成為肝癌基因治療的新靶點(diǎn)。 第三部分:化療藥物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中端粒酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的變化 目的:探討hTERT和端粒酶在化療藥物誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中的作用及其意義。 方法:選擇IC50劑量的三尖杉酯堿、長(zhǎng)春新堿和足葉已甙處理肝癌細(xì)胞，采用TRAP法檢測(cè)藥物處理前后肝癌細(xì)胞端粒酶活性；應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率；并利用WesternBlotting