糖皮質(zhì)激素下調(diào)microRNA-155發(fā)揮抑炎作用的機(jī)制研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素是治療炎癥及自身免疫性疾病的常見(jiàn)藥物。內(nèi)源性及外源性合成的糖皮質(zhì)激素均能有效抑制炎癥反應(yīng)，糾正炎癥反應(yīng)的失衡，避免過(guò)度或持續(xù)炎癥所引起的組織損傷。正由于療效顯著，糖皮質(zhì)激素?cái)?shù)十年來(lái)一直應(yīng)用于臨床一線，廣泛用于敗血癥性休克、哮喘、炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥等炎癥相關(guān)性疾病的治療。然而，由于長(zhǎng)期使用所帶來(lái)的副作用及日益增加的耐藥性，糖皮質(zhì)激素的臨床效能正面臨前所未有的挑戰(zhàn)。因而，深入研究和進(jìn)一步闡明糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)理

2、是一項(xiàng)重要的科學(xué)問(wèn)題。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)廣為人們認(rèn)可的糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制是基因組學(xué)說(shuō)，即：通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核后，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(Glucocorticoid responsive element，GRE)結(jié)合或者與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而直接或間接調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。以往的研究主要聚焦在信號(hào)分子及炎癥介質(zhì)等蛋白編碼基因上，而對(duì)

3、于與基因表達(dá)異常關(guān)系密切的非編碼序列如microRNAs(miRNAs)的作用則知之甚少。
　　 近年來(lái)，miRNA已成為基因表達(dá)調(diào)控的“明星”分子。它們由細(xì)胞內(nèi)核基因組轉(zhuǎn)錄為RNA，經(jīng)過(guò)Drosha和Dicer酶剪切加工后，成為成熟的miRNA。成熟miRNA的種子序列可與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或者蛋白翻譯抑制。越來(lái)越多的證據(jù)表明：miRNA是機(jī)體內(nèi)各種生理及病理活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與固有

4、免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是固有免疫細(xì)胞重要的識(shí)別受體，可結(jié)合病原體的特定結(jié)構(gòu)成分，從而激活免疫細(xì)胞。其中，TLR4信號(hào)通路的活化，誘導(dǎo)大量不同的miRNA，例如miR-146a，miR-147，let-7e，let-7j和miR-155表達(dá)上調(diào)等；而這些miRNA又可靶向抑制某些信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的表達(dá)，反饋調(diào)控TLR4信號(hào)通路的強(qiáng)度，從而促進(jìn)或者抑制炎癥應(yīng)答。這些研究結(jié)果提示：

5、miRNA在炎癥應(yīng)答中扮演著重要角色。那么，糖皮質(zhì)激素是否調(diào)控miRNA的表達(dá)?miRNA是否參與糖皮質(zhì)激素的抑炎作用?作用機(jī)制又如何?目前，均未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。
　　 有鑒于此，我們以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型為研究對(duì)象，利用基因芯片等技術(shù)系統(tǒng)分析了糖皮質(zhì)激素地塞米松對(duì)miRNA表達(dá)譜的改變情況，并對(duì)糖皮質(zhì)激素調(diào)控miRNA表達(dá)的機(jī)制、miRNA參與糖皮質(zhì)激素抑炎的作用及

6、分子機(jī)制展開(kāi)研究，以期闡明糖皮質(zhì)激素抗炎的非編碼RNA機(jī)制，為后續(xù)的藥物開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分糖皮質(zhì)激素影響microRNAs在炎癥反應(yīng)中的表達(dá)
　　 巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在炎癥反應(yīng)中起十分關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞滲出是炎癥反應(yīng)最主要的特征。滲出的巨噬細(xì)胞是一柄雙刃劍，一方面，巨噬細(xì)胞被激活后，釋放炎性介質(zhì)，激活免疫系統(tǒng)，有效地殺傷病原體，構(gòu)成炎癥反應(yīng)的防御環(huán)節(jié)；另一方面，巨噬細(xì)

7、胞過(guò)度激活則釋放過(guò)量炎性介質(zhì)、蛋白水解酶及氧自由基等加重組織損傷并延長(zhǎng)炎癥過(guò)程。Raw264.7細(xì)胞是小鼠來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞系，在受到LPS刺激時(shí)，可模擬機(jī)體炎癥細(xì)胞的反應(yīng)狀態(tài)，已成為一種常見(jiàn)的炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于炎癥領(lǐng)域的相關(guān)研究。
　　 據(jù)此，我們首先以LPS刺激Raw264.7細(xì)胞建立炎癥反應(yīng)模型，加入糖皮質(zhì)激素地塞米松24h后，用Realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)水平的改變，并用ELISA檢測(cè)細(xì)胞外炎癥

8、介質(zhì)的釋放情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地塞米松可在mRNA水平下調(diào)TNF-a、IL-6及iNOS的表達(dá)，抑制丁NF-a、IL-6及NO的合成及釋放，提示糖皮質(zhì)激素可顯著抑制LPS所介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　 為了進(jìn)一步研究糖皮質(zhì)激素對(duì)miRNA表達(dá)譜系的影響，我們以上述炎癥模型為基礎(chǔ)，利用基因芯片技術(shù)，系統(tǒng)分析了糖皮質(zhì)激素對(duì)miRNA表達(dá)的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPS可上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)96個(gè)miRNA的表達(dá)，下調(diào)30個(gè)miRNA的表達(dá)；在加

9、入地塞米松后，與LPS+DMSO組相比，可上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)96個(gè)miRNA的表達(dá)量，而下調(diào)的miRNA數(shù)量則為137個(gè)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們挑選了其中部分與炎癥密切相關(guān)的miRNA及表達(dá)差異較大的miRNA進(jìn)行Realtime PCR的驗(yàn)證，結(jié)果顯示：糖皮質(zhì)激素可顯著下調(diào)miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301b的表達(dá)，而對(duì)let-7i及l(fā)et-7e的表達(dá)無(wú)明顯影

10、響。
　　 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素除了調(diào)控編碼蛋白基因表達(dá)外，對(duì)蛋白非編碼的miRNA亦具有明顯的調(diào)控作用。 第二部分 糖皮質(zhì)激素下調(diào)mieroRNA-155發(fā)揮抑炎作用
　　 第一部分的結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素可以明顯影響miRNA的表達(dá)譜系的變化，那么miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301等這些變化的microRNA在糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)中

11、的作用如何?為此，我們首先采用電轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)染miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301模擬物(mimics)以上調(diào)這些miRNAs在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；其后，再進(jìn)行地塞米松處理及LPS刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)miR-155可顯著拮抗地塞米松對(duì)TNF-a、IL-6及NO等炎癥介質(zhì)的抑制作用，提示miR-155參與糖皮質(zhì)激素抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。 為了

12、進(jìn)一步探討這種下調(diào)的miR-155表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，我們利用miR-155抑制劑(inhibitor)干擾Raw264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)后，再進(jìn)行LPS刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-155表達(dá)的下調(diào)可削弱LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。該作用與糖皮質(zhì)激素的作用一致，表明下調(diào)miR-155的表達(dá)是糖皮質(zhì)激素抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要分子機(jī)制。
　　 miRNA發(fā)揮作用的經(jīng)典模式是與靶基因m

13、RNA的3’端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白翻譯抑制。為進(jìn)一步探討miR-155參與糖皮質(zhì)激素抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)對(duì)其可能的靶基因進(jìn)行科學(xué)預(yù)測(cè)和初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PicTar，Target Scan及miRanda等三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息搜尋及交集運(yùn)算分析發(fā)現(xiàn)了83個(gè)miR-155潛在靶基因；在這些靶基因中，SOCS1是具有顯著抑炎功能的分子，因此我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：miR-15

14、5可抑制含SOCS13’UTR序列報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性；Western blot檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)，在Raw264.7細(xì)胞中，miR-155 mimics可顯著下調(diào)SOCS1蛋白水平的表達(dá)。這些結(jié)果表明，SOCS1是miR-155的靶基因。此外，我們還進(jìn)一步研究了地塞米松對(duì)SOCS1基因表達(dá)的影響，LPS刺激的Raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，經(jīng)糖皮質(zhì)激素地塞米松干預(yù)后，western blot檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞中SOCS1蛋白水平

15、的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)SCOS1的表達(dá)。 本部分結(jié)果表明，miR-155參與糖皮質(zhì)激素抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)；下調(diào)miR-155的表達(dá)從而上調(diào)其靶基因SOCS1的表達(dá)，是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制之一。 第三部分 糖皮質(zhì)激素對(duì)microRNA-155的調(diào)控機(jī)制研究
　　 為進(jìn)一步明確糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155表達(dá)的調(diào)控作用，我們?cè)贚PS誘導(dǎo)的原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及人THP-1單核細(xì)胞炎癥模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)

16、證糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與在Raw264.7細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，糖皮質(zhì)激素地塞米松對(duì)原代巨噬細(xì)胞及人單核細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)亦有顯著抑制作用。此外，我們進(jìn)一步以LPS建立動(dòng)物炎癥模型，經(jīng)地塞米松處理后，檢測(cè)脾臟及肝臟中miR-155的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，地塞米松處理組小鼠脾臟及肝臟中miR-155的表達(dá)量亦發(fā)生下調(diào)。這些結(jié)果提示：糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155的調(diào)控作用具有一定的廣泛

17、性，而非單一的細(xì)胞依賴性。
　　 糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用主要通過(guò)經(jīng)典的受體依賴途徑及受體非依賴途徑。為進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，我們以糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU486預(yù)處理Raw264.7細(xì)胞后，再加入地塞米松及LPS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RU486可完全阻斷地塞米松對(duì)miR-155表達(dá)的影響。結(jié)果提示，糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155表達(dá)的調(diào)控作用具有受體依賴性。 MAPK及NF-κB通路是LPS激活TLR4后發(fā)揮功能的重

18、要信號(hào)傳導(dǎo)途徑。為研究糖皮質(zhì)激素對(duì)miR-155表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，我們首先探討糖皮質(zhì)激素對(duì)MAPK及NF-κB通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地塞米松可顯著抑制LPS所介導(dǎo)的MAPK家族中p38的磷酸化，而對(duì)ERK及JNK的磷酸化無(wú)明顯影響；此外，地塞米松亦可抑制LPS所介導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)位。為進(jìn)一步探討p38及NF-κB通路在LPS誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)中的作用，我們采用p38抑制劑SB203580阻斷p38通路后，LPS仍可上調(diào)miR-15

19、5的表達(dá)，且表達(dá)量未見(jiàn)明顯改變；相反，采用NF-κB抑制劑BAY11-7082阻斷NF-κB通路后，LPS所誘導(dǎo)的miR-155表達(dá)量發(fā)生下降，提示NF-κB通路而非p38通路參與LPS所介導(dǎo)的miR-155表達(dá)上調(diào)。因此，這些結(jié)果表明：地塞米松主要是通過(guò)抑制NF-κB通路的激活從而影響LPS所介導(dǎo)的miR-155表達(dá)。 Pri-miR-155及pre-miR-155是成熟miR-155的前體，我們?cè)贚PS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型上檢

20、測(cè)糖皮質(zhì)激素對(duì)pri-miR-155及pre-miR-155表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地塞米松可顯著下調(diào)LPS所誘導(dǎo)的pri-miR-155及ore-miR-155表達(dá)。這提示，地塞米松對(duì)miR-155的抑制作用可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄起始水平。因而，我們對(duì)miR-155宿主基因BIC(B-cell integration cluster)的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。對(duì)BIC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5000bp至下游500bp的DNA區(qū)域的分析的結(jié)果顯示，在該區(qū)

21、域不含糖皮質(zhì)激素的直接結(jié)合位點(diǎn)GREs；相反，在該區(qū)域里存在NF-κB、AP-1及Ets-1等結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)NF-κB位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，地塞米松對(duì)miR-155表達(dá)的抑制作用消失。這些結(jié)果表明，BIC上NF-κB結(jié)合位點(diǎn)以及NF-κB通路是地塞米松是于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型上調(diào)控miR-155表達(dá)的關(guān)鍵位點(diǎn)及關(guān)鍵信號(hào)分子途徑。
　　 綜上所述，我們首次系統(tǒng)分析了糖皮質(zhì)激素對(duì)miRNA表達(dá)譜系的影響，發(fā)現(xiàn)miR-155參與糖