碘乙酰胺（IA）誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞水通道蛋白1（AQP1）的表達(dá).pdf

1、AQPs是最近發(fā)現(xiàn)的水通道家族。其中水通道蛋白AQP1是一種最先從紅細(xì)胞分離出來的28kDa蛋白，它在腎臟、肺、腦和眼均有表達(dá)，其調(diào)節(jié)機(jī)制是復(fù)雜的。體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞自然表達(dá)AQP1，故本文以小鼠成纖維細(xì)胞為研究對象，通過碘乙酰胺模擬低氧，探討其在等滲和高滲不同狀態(tài)下AQP1表達(dá)的變化。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)和收集。 小鼠成纖維細(xì)胞用含有10％FBS的培養(yǎng)液，放于37℃，5％CO<,2>的孵箱中培養(yǎng)。另向培養(yǎng)

2、液中加入山梨醇配成0.1M和0.4M的高滲培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞分別用等滲和高滲培養(yǎng)液孵育，并向其中加入碘乙酰胺(30umol/L)，分別于0h，4h及6h收集細(xì)胞并凍結(jié)。用冰一細(xì)胞裂解液重懸浮細(xì)胞沉淀，形成一個(gè)凍融循環(huán)。細(xì)胞上清以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。 2．SDS/PAGE and Western blotting。 細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行SDS/PAGE凝膠電泳，并且將免疫印記蛋白轉(zhuǎn)印到膜上。用化學(xué)發(fā)光和

3、放射自顯影術(shù)增強(qiáng)免疫印記使之可見。用凝膠圖象分析系統(tǒng)測定相對密度。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 測定每組通過放射自顯影術(shù)得到的蛋白免疫印記結(jié)果的密度，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對不同干涉用非配對t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化正常時(shí)，細(xì)胞主要呈梭形，多角狀，分裂相細(xì)胞呈類圓形，單層貼壁生長。在給予IA 4小時(shí)細(xì)胞形態(tài)變圓，體積變大；6小時(shí)細(xì)胞核增大，細(xì)胞溶解壞死。 2．Western-blot

4、免疫印記檢測結(jié)果通過免疫印記定量測定，細(xì)胞等滲培養(yǎng)滴加IA(30umol/L)4小時(shí)，AOP1表達(dá)增加24.4％(n=6，P>0.05)。6小時(shí)AOP1表達(dá)增加193.8％(n=6，P<0.05)。 細(xì)胞0.1M高滲培養(yǎng)滴加IA(30umol/L)4小時(shí)AQP1表達(dá)增加84.7％(n=2，P>0.05)，6小時(shí)AQP1表達(dá)增加63.8％(n=2，P>0.05)。 細(xì)胞0.4M高滲培養(yǎng)后AQP1處于高表達(dá)，滴加IA 4小時(shí)

5、AQP1表達(dá)略有降低，為8.9％，6小時(shí)AQP1表達(dá)增加26.2％。 比較高滲培養(yǎng)和等滲培養(yǎng)，高滲培養(yǎng)滴加IA后AQP1表達(dá)峰值前提。 討論： 研究表明，在有水通道蛋白表達(dá)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其水滲透性也高；在接近出生時(shí)肺水通道蛋白的表達(dá)是增加的；AQP1敲除小鼠肺泡一毛細(xì)血管間水的滲透性水通透性較野生型降低；腎臟、體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞和在體小鼠高滲均誘導(dǎo)AQP1的表達(dá)。 研究顯示由碘乙酰胺模擬缺氧