應(yīng)用SELDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)構(gòu)建臨床常見(jiàn)病原菌蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù).pdf

1、 目的：分析臨床常見(jiàn)病原菌 SELDI-TOF MS 蛋白指紋圖譜，篩選穩(wěn)定表達(dá)蛋白標(biāo)志物，建立9種細(xì)菌蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用臨床菌株對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力進(jìn)行驗(yàn)證，為細(xì)菌感染的快速診斷奠定基礎(chǔ)。
方法：1. 收集四川省人民醫(yī)院2012年5月至2012年9月臨床分離經(jīng)全自動(dòng)微生物分析儀鑒定的菌株。2. 擴(kuò)增16S rRNA基因?qū)?xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。3. 通過(guò)不同點(diǎn)樣孔和不同Au芯片上多次重復(fù)檢測(cè)同一株細(xì)菌蛋白，分析其蛋白指紋

2、圖譜差異，評(píng)價(jià)質(zhì)譜儀和芯片檢測(cè)細(xì)菌蛋白的重復(fù)性。4. 比較3株參考菌株在不同培養(yǎng)基中蛋白指紋圖譜差異，分析不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌蛋白指紋圖譜的影響。5. 比較細(xì)菌蛋白指紋圖譜在不同培養(yǎng)時(shí)間下的差異，分析培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌蛋白圖譜的影響。6. 比較同種細(xì)菌不同株之間蛋白指紋圖譜差異，驗(yàn)證同種細(xì)菌蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。7. 比較不同種細(xì)菌蛋白指紋圖譜差異，分析其差異。8. 將收集的菌株分為建模組和驗(yàn)證組：臨床分離細(xì)菌147株與7株參考菌株設(shè)為建模組，其余

3、378株臨床分離菌株為驗(yàn)證組。分別檢測(cè)其蛋白表達(dá)，分析蛋白指紋圖譜；篩選出建模組中9種細(xì)菌各自穩(wěn)定表達(dá)的蛋白峰，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入自建的Fingerwave軟件，構(gòu)建細(xì)菌蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)。9. 將378株驗(yàn)證組細(xì)菌的蛋白峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入Fingerwave軟件與蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似度比較，對(duì)蛋白指紋庫(kù)的鑒定能力進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果：1. 收集臨床9種細(xì)菌525株，包括表皮葡萄球菌38株，鮑曼不動(dòng)桿菌54株，大腸桿菌123株，肺炎克雷伯菌99株

4、，糞腸球菌22株，金黃色葡萄球菌50株，銅綠假單胞菌83株，屎腸球菌22株和陰溝腸桿菌34株。2. 實(shí)驗(yàn)菌株16S rRNA測(cè)序結(jié)果與GenBank中該菌株基因序列一致性均≥98%，鑒定為相應(yīng)的細(xì)菌。3. 分析同株細(xì)菌蛋白指紋圖譜，其主要蛋白峰在孔間和芯片間分子量變異系數(shù)均≤0.05%。4. 比較不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的同株菌蛋白指紋圖譜，顯示在不同培養(yǎng)媒介其細(xì)菌特征蛋白恒定表達(dá)。5. 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)影響很小，其蛋白指紋圖譜共有蛋

5、白峰分子量變異系數(shù)均≤0.2%。6. 同種細(xì)菌不同株之間蛋白指紋圖譜共有蛋白峰分子量變異系數(shù)均≤0.5%，細(xì)菌蛋白表達(dá)穩(wěn)定。7. 在分子量3 000-20 000Da范圍內(nèi)，臨床常見(jiàn)9種細(xì)菌有各自特異的蛋白指紋圖譜。8. 篩選出9種細(xì)菌蛋白指紋圖譜各自穩(wěn)定表達(dá)的蛋白峰，初步建立臨床常見(jiàn)9種病原菌的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)。9. 將驗(yàn)證組菌株蛋白指紋數(shù)據(jù)與建立的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果的符合率分別為表皮葡萄球菌95.0%(19/20)、鮑曼

6、不動(dòng)桿菌85.3%(29/34)、大腸埃希菌96.2%(101/105)、糞腸球菌100%(11/11)、肺炎克雷伯菌88.8%(71/80)、銅綠假單胞菌90.5%(57/63)、金黃色葡萄球菌97.5%(39/40)、屎腸球菌81.8%(9/11)和陰溝腸桿菌85.7%(12/14)。
結(jié)論：利用SELDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌蛋白結(jié)合自建Fingerwave軟件建立的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白指紋數(shù)據(jù)相似度比較，可同時(shí)