免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid的基因構(gòu)建、表達(dá)及對(duì)HBsAg陽(yáng)性肝細(xì)胞癌的殺傷作用.pdf

1、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高，傳統(tǒng)放、化療對(duì)正常組織毒害大，本組建立的免疫促凋亡策略已經(jīng)在 HER2腫瘤模型中證實(shí)具有明確的抗腫瘤作用，該策略靶向性高、副作用小，有希望推廣應(yīng)用于HCC的抗腫瘤治療。關(guān)鍵問題是首先獲得能夠特異地識(shí)別HCC腫瘤標(biāo)志物的單鏈抗體，以此抗體構(gòu)建免疫促凋亡分子，使之靶向殺傷HCC腫瘤細(xì)胞。
　　本課題組曾從噬菌體抗體庫(kù)篩選、改造

2、獲得一株對(duì)HBsAg具有親和活性并可經(jīng)由內(nèi)吞體進(jìn)入HBsAg陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的人源性單鏈抗體（scFv15），并證實(shí)了由scFv15/魚精蛋白構(gòu)成的重組分子能夠?qū)⑿『怂犷愋?yīng)分子特異地輸送到HBsAg陽(yáng)性肝癌細(xì)胞中，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，為將該單鏈抗體用于構(gòu)建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　靶向 HBsAg的免疫促凋亡分子由三部分組成：特異識(shí)別 HBsAg的scFv15、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和促凋亡分子。免疫促凋亡分子由sc

3、Fv15介導(dǎo)靶向進(jìn)入HBsAg陽(yáng)性肝癌細(xì)胞后，其抗腫瘤作用的強(qiáng)弱取決于兩個(gè)要素。
　　第一個(gè)要素是促凋亡分子必須經(jīng)過優(yōu)化，具有盡可能強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。本課題組曾篩選比較了caspase-3、caspase-6、granzyme B、AIF、tBid等多種人體自身促凋亡分子，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，tBid具有分子量小、滲透性強(qiáng)、誘導(dǎo)凋亡時(shí)效短、促凋亡效應(yīng)強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究采用tBid作為促凋亡效應(yīng)分子。
　　第二個(gè)要素是免疫促

4、凋亡分子必須能夠從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞漿，具有盡可能高的內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位效率。這是因?yàn)槊庖叽俚蛲龇肿觾?nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，包裹于內(nèi)吞體中，必須從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位釋放到胞漿，才能發(fā)揮殺傷效應(yīng)。免疫促凋亡分子的轉(zhuǎn)位過程包括兩步：一是內(nèi)吞體中的Furin蛋白酶切割免疫促凋亡分子，使單鏈抗體部分與促凋亡分子分離；二是內(nèi)吞體膜被破壞，促凋亡分子釋放到胞漿。
　　我們以往的研究已經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)位的兩步驟進(jìn)行了優(yōu)化：第一步的優(yōu)化結(jié)果顯示，白喉毒素的Furin識(shí)別序列（F

5、dt）的切割效率最高；第二步的優(yōu)化結(jié)果顯示，流感病毒血凝素蛋白中的HA2序列破壞內(nèi)吞體膜的能力最強(qiáng)，但HA2序列在融合蛋白中所處的位置是否影響其轉(zhuǎn)位功能尚不清楚。
　　本研究首先觀察了HA2序列的位置與轉(zhuǎn)位功能的關(guān)系。將 HA2序列分別融合于scFv15的N端和C端，只有HA2-scFv15能夠破壞內(nèi)吞體膜，使標(biāo)記FITC的指示分子彌散性分布于胞漿，因此本研究選擇將HA2融合于效應(yīng)分子的N端。
　　基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究將

6、scFv15、Fdt、HA2、tBid四部分融合表達(dá)，構(gòu)建靶向HBsAg的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid。該分子具有Fdt序列，可在內(nèi)吞體中經(jīng)Furin蛋白酶切割，將HA2暴露于多肽鏈N末端，進(jìn)而破壞內(nèi)吞體膜，釋放tBid進(jìn)入胞漿發(fā)揮殺傷效應(yīng)。構(gòu)建不含HA2序列的免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-tBid作為對(duì)照。
　　體外實(shí)驗(yàn)表明，scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid都具

7、有良好的抗原靶向性，可以特異性結(jié)合HBsAg陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；融合有HA2序列的scFv15-Fdt-HA2-tBid分子較scFv15-Fdt-tBid能更快速的突破內(nèi)吞體限制，轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞漿。scFv15-Fdt-tBid和scFv15-Fdt-HA2-tBid對(duì)HBsAg陰性細(xì)胞無明顯毒性，但能通過誘導(dǎo)凋亡顯著降低HBsAg陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞存活率，且scFv15-Fdt-HA2-tBid的作用更強(qiáng)。免疫促凋亡分子的促凋亡效應(yīng)與線粒體凋亡通路

8、的激活有關(guān)，伴隨著線粒體膜電位降低，caspase-9和caspase-3的活化。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)尾靜脈注入肝原位荷瘤裸鼠體內(nèi)的免疫促凋亡分子，能夠逐漸向腫瘤所在位置富集，對(duì)其他正常組織臟器的累積分布較少，證明免疫促凋亡分子具有良好的在體靶向性及組織滲透性。免疫促凋亡分子治療后，瘤體增長(zhǎng)速度均顯著減緩；相對(duì)于 scFv15-Fdt-tBid，scFv15-Fdt-HA2-tBid具有更強(qiáng)的腫瘤增殖抑制作用，能夠更高效地誘導(dǎo)腫

9、瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　以正常 Balb/c小鼠對(duì)scFv15-Fdt-HA2-tBid進(jìn)行在體安全性檢測(cè)，10倍劑量仍未表現(xiàn)出對(duì)重要臟器的損傷作用，沒有引起明顯的炎癥反應(yīng)，提示scFv15-Fdt-HA2-tBid具有良好的體內(nèi)應(yīng)用安全性。
　　綜上所述，免疫促凋亡分子scFv15-Fdt-HA2-tBid在體內(nèi)外均可以靶向結(jié)合HBsAg陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，具有較強(qiáng)的特異性和良好的滲透性；HA2序列的引入可以促進(jìn)凋亡效應(yīng)分子向胞漿