血管緊張素Ⅱ2型受體在實驗性關(guān)節(jié)炎的作用及部分機制.pdf

1、血管緊張素Ⅱ是血管緊張素原在腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme, ACE）的作用下或者通過糜蛋白酶等非ACE途徑形成的八肽化合物。血管緊張素Ⅱ的受體包括1型受體（angiotensinⅡ type1 receptor, AT1R）和2型受體（angiotensinⅡtype2 receptor, AT2R），二者與血管緊張素Ⅱ的親和力相似。血管緊張素 II通過AT1R在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著收縮

2、血管、調(diào)節(jié)血壓和水鈉平衡等作用。在高血壓、充血性心力衰竭等心血管疾病治療中廣泛使用的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEIs）和1型受體阻斷劑（angiotensinⅡ type1 receptor blockers, ARBs）就是分別通過限制血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生或者阻斷血管緊張素Ⅱ與AT1R受體的結(jié)合來發(fā)揮治療效應(yīng)。單核/巨噬細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞等炎

3、癥免疫細胞均擁有獨立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)。血管緊張素Ⅱ以自分泌或旁分泌的形式與炎癥免疫細胞上的AT1R作用，通過刺激單核細胞趨化移行、誘導(dǎo)樹突狀細胞分化成熟、促進 T淋巴細胞活化增殖、增強Th1和Th17免疫功能，進而參與炎癥免疫反應(yīng)。血管緊張素II在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）等自身免疫病的致病機制中發(fā)揮重要作用，ACEIs和ARBs分別通過阻斷血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生和其與受體的相互作用，進而緩解 R

4、A等自身免疫病患者的炎癥免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在AT2R基因敲除小鼠上建立動脈粥樣硬化、腦缺血再灌注損傷、血管損傷重塑的疾病模型，與正常小鼠相比，AT2R的缺失會導(dǎo)致模型小鼠疾病的惡化。相反，AT2R轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌肥大、動脈粥樣硬化等疾病表現(xiàn)得到了有效地緩解，提示AT2R可能在疾病病程中發(fā)揮保護性作用。利用藥理學(xué)工具研究發(fā)現(xiàn)，AT2R激動劑CGP42112和C21具有舒張血管內(nèi)皮、抑制炎癥反應(yīng)、促進神經(jīng)元修復(fù)再生等作用。一般而言，當(dāng)阻斷

5、血管緊張素 II與AT1R的結(jié)合時，游離的血管緊張素Ⅱ水平會隨之增高，并且反饋性的與另一個受體AT2R作用，繼而發(fā)揮AT2R的保護性功能，這個假設(shè)在氯沙坦治療主動脈瘤和高血壓腎病的研究中都被予以證實。目前AT2R在RA及其實驗關(guān)節(jié)炎動物模型中的作用未見報道。本課題通過建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis, AIA）模型，探討AT2R在AIA炎癥免疫反應(yīng)中的變化和作用，研究AT2R激動劑對實驗性關(guān)節(jié)炎

6、的治療作用及部分機制，為發(fā)現(xiàn)AT2R參與調(diào)控RA炎癥免疫反應(yīng)的作用以及成為新靶點的可能性提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　本課題建立大鼠AIA模型，探討AT2R在實驗性關(guān)節(jié)炎和RA患者中的變化及其作用，觀察關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動劑CGP42112對繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎的治療作用，研究AT2R對體外培養(yǎng)的AIA大鼠單核細胞的影響。為明確AT2R在調(diào)控RA炎癥免疫反應(yīng)中的作用以及能否成為治療RA的新靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法：

7、r>　　SD大鼠右后足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant, CFA）建立大鼠AIA模型。造模后第14天采用灌胃方式給予AIA大鼠氯沙坦（5，10，15 mg/kg），每天給藥1次，療程持續(xù)15天，第28天處死大鼠，甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）（0.5 mg/kg）作為陽性對照藥。觀察大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)和病理組織學(xué)評價的變化；采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked i

8、mmunosorbent assay, ELISA）法檢測大鼠血清、滑膜中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、血管緊張素II水平的變化。采用Western blot法檢測大鼠脾臟、滑膜中AT1R、AT2R蛋白的表達，并使用Spearman法分析AIA大鼠AT1R、AT2R蛋白表達與多

9、發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性。分離大鼠外周血的單核細胞，采用Western blot法檢測大鼠單核細胞AT1R、AT2R蛋白的表達。
　　收集健康志愿者和12例活動期RA患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），利用定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）法和流式細胞術(shù)檢測AT1R、AT2R的變化。

10、r>　　建立AIA大鼠模型（方法同上），采用關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動劑CGP42112（5，10，20μg/kg）觀察其對AIA大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎的治療作用，第14天開始給藥，每隔3天給藥1次，療程持續(xù)15天，以醋酸曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）（1 mg/kg）注射液作為陽性對照藥。觀察大鼠左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、病理組織學(xué)評價、滑膜組織CD11b陽性細胞浸潤的變化；分離并體外培養(yǎng)大鼠滑膜細

11、胞，采用CCK-8試劑盒檢測滑膜細胞增殖的變化。
　　分離并體外培養(yǎng)模型組大鼠單核細胞，采用 Western blot法檢測 CGP42112（10-6M）和氯沙坦（10-6M）對單核細胞AT1R、AT2R蛋白表達的影響；采用CCK-8試劑盒檢測AT2R激動劑CGP42112（10-10至10-5M）對大鼠單核細胞活性的影響；采用 Transwell法檢測 CGP42112（10-8至10-5M）和氯沙坦（10-6M）對大鼠單核細

12、胞趨化的作用。
　　結(jié)果：
　　1. AIA大鼠和RA患者的AT2R表達顯著增高，且AT2R表達的上調(diào)與AIA大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)減輕相關(guān)
　　與正常組相比，模型組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高。對于滑膜炎的組織病理學(xué)評價表明，模型組大鼠滑膜炎表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腔積液，炎性滲出，滑膜細胞增生，血管翳形成，滑膜組織內(nèi)小血管增生，大量炎細胞浸潤，嚴重者增生的滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨。與正常組相比，ELISA檢測結(jié)果表明，模型

13、組大鼠血清和滑膜中TNF-α、VEGF以及血清中血管緊張素II的水平顯著升高。Western blot的結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠脾臟、滑膜中AT1R和AT2R蛋白的表達均顯著升高。分離大鼠單核細胞，Western blot的結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠單核細胞的AT1R、AT2R蛋白表達均顯著增高。收集RA患者外周血，qPCR的檢測結(jié)果表明，與健康志愿者相比，RA患者PBMCs的AT1R和AT2R mRNA水平顯著增高。

14、流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果進一步表明，RA患者PBMCs的AT1R和AT2R表達顯著升高。
　　第22、26天時，與模型組相比，氯沙坦（10，15 mg/kg）組和MTX（0.5 mg/kg）組大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低。與模型組相比，氯沙坦（15 mg/kg）組和MTX（0.5 mg/kg）組大鼠的滑膜細胞增生、炎細胞的浸潤和血管翳的出現(xiàn)，以及軟骨和骨的侵蝕等滑膜炎病理學(xué)表現(xiàn)得到顯著減輕。與模型組相比，氯沙坦（5，10，15 mg

15、/kg）組和MTX（0.5 mg/kg）組大鼠的TNF-α、VEGF、血管緊張素II水平均得到不同程度的降低。與模型組相比，氯沙坦（5，10，15 mg/kg）組和MTX（0.5 mg/kg）組大鼠脾臟、滑膜中AT1R蛋白的表達不同程度顯著降低；氯沙坦（10，15 mg/kg）組大鼠脾臟、滑膜中AT2R蛋白的表達不同程度顯著升高。與模型組相比，氯沙坦（15 mg/kg）組大鼠單核細胞的AT1R蛋白表達顯著降低、AT2R蛋白表達顯著增高。

16、對AIA大鼠AT1R、AT2R蛋白表達與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的相關(guān)性分析表明，脾臟、滑膜中AT1R蛋白表達與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈正相關(guān)，即AT1R蛋白表達的上調(diào)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的增高相關(guān)；而脾臟、滑膜中AT2R蛋白表達與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈負相關(guān)，即AT2R蛋白表達的上調(diào)與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的減輕相關(guān)。
　　2.關(guān)節(jié)腔注射CGP42112時，激動AT2R可以緩解AIA大鼠體內(nèi)的繼發(fā)側(cè)炎癥免疫反應(yīng)
　　初步研究表明AT2R參與了AIA

17、和RA的疾病病程，且高表達的AT2R與大鼠關(guān)節(jié)炎的緩解密切相關(guān)，為了明確AT2R在調(diào)控AIA炎癥免疫反應(yīng)中的作用，因此我們在整體給藥的情況下進一步研究左后足踝關(guān)節(jié)腔注射AT2R激動劑CGP42112對AIA大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)炎的作用。與正常組相比，模型組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高；第22、26天時，與模型組相比，CGP42112（10,20μg/kg）組和TA（1 mg/kg）組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低。與正常組相比，模型

18、組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高；第22、26天時，與模型組相比，CGP42112（10,20μg/kg）組和TA（1 mg/kg）組大鼠繼發(fā)側(cè)左后足關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低。組織病理學(xué)評價表明，與模型組相比，CGP42112（20μg/kg）組和TA（1 mg/kg）組大鼠滑膜炎各單項的病理學(xué)評分包括滑膜細胞增生、炎細胞的浸潤和血管翳的出現(xiàn)，以及軟骨和骨的侵蝕均顯著減輕。免疫組化結(jié)果表明，與模型組相比，CGP42112（20μg/kg）

19、組和TA（1 mg/kg）組大鼠的滑膜組織CD11b陽性細胞浸潤明顯減輕。與正常組相比，模型組大鼠的滑膜細胞顯著增殖；與模型組相比，CGP42112（10,20μg/kg）組和TA（1 mg/kg）組大鼠的滑膜細胞增殖受到顯著抑制。
　　3.激動AT2R可抑制體外培養(yǎng)的單核細胞活性
　　為了探討激動AT2R緩解AIA大鼠炎癥免疫反應(yīng)的作用機制，我們分離并體外培養(yǎng)模型組大鼠單核細胞，Western blot的檢測結(jié)果表明，CG

20、P42112（10-6M）和氯沙坦（10-6M）顯著降低單核細胞AT1R蛋白的表達，顯著升高大鼠單核細胞AT2R蛋白的表達。CCK-8檢測的結(jié)果表明，AT2R激動劑CGP42112（10-10至10-5M）對大鼠單核細胞的活性發(fā)揮不同程度的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration50％, IC50）的值為5.21×10-6 M。Transwell實驗檢測的結(jié)果表明， CGP42112（10-7至10-5

21、M）和氯沙坦（10-6M）顯著減弱胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和IL-1β誘導(dǎo)的大鼠單核細胞趨化。
　　結(jié)論：
　　1. AIA大鼠脾臟、滑膜組織及單核細胞和RA患者外周血中AT2R表達顯著升高，且AT2R表達上調(diào)與AIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)減輕相關(guān)，提示AT2R在RA病程進展中可能發(fā)揮緩解炎癥免疫反應(yīng)的作用。
　　2.關(guān)節(jié)腔注射CGP42112改善AIA大鼠繼發(fā)側(cè)左后足的關(guān)節(jié)滑膜炎，抑制