人參皂苷C-K對小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的作用及部分機制.pdf

1、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是T、B淋巴細胞參與的,以損害滑膜、軟骨和骨為主的系統(tǒng)性自身免疫疾病。在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中,免疫調(diào)節(jié)的異常是疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵,其中 T淋巴細胞的異常增殖活化、各種細胞因子的分泌及Th細胞亞群比例的失衡與疾病的發(fā)病及病理損傷密切相關(guān),其在誘導、維持自身免疫耐受性和阻止自身免疫中起重要作用。人參皂苷 C-K(ginsenoside compound K,C-K)不僅具有

2、抗突變、抑制癌細胞轉(zhuǎn)移、細胞毒、誘導細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)藥物耐藥和抗腫瘤誘導的血管新生等藥理活性外,其抗炎、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)作用也日益受到關(guān)注。本研究在建立 DBA/1小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型基礎(chǔ)上,研究C-K對小鼠CIA的治療作用,并對其部分作用機制進行了探討。
　　目的:明確C-K對小鼠CIA的治療作用,并揭示C-K治療小鼠CIA作用特點及部分機制。
　　方法:DBA

3、/1小鼠分別d0和d21,尾根部、背部多點皮內(nèi)注射100μg雞Ⅱ型膠原乳劑誘導小鼠CIA模型。造模成功的DBA/1小鼠,隨機分為8組,即正常組、模型組、C-K組(7,14,28,56,112 mg/kg/次,灌胃,每天一次)、MTX組(2 mg/kg,灌胃,每三天一次)。d51處死小鼠,觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分,關(guān)節(jié)和脾臟病理檢查及病理學評分,胸腺指數(shù)和脾指數(shù);3H-TdR摻入法觀察各給藥組對T、B淋巴細胞增殖功能的影響;ELISA法檢測培養(yǎng)

4、上清中ELISA法檢測體內(nèi)給藥小鼠血清中抗II型膠原(collagen II,CII)抗體、抗環(huán)瓜氨酸(cyclic citrulline polypeptide,CCP)抗體、IgG1和IgG2a水平,關(guān)節(jié)勻漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-1β、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for n

5、uclear factor-κB ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)水平;流式細胞術(shù)檢測脾臟T、B淋巴細胞各亞群比率的變化情況,流式細胞術(shù)和Western blot共同檢測脾臟中TCR、CD28、CTLA-4、PD-1蛋白表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.C-K對CIA小鼠體重和全身表現(xiàn)評分的影響
　　CIA小鼠免疫d3以后,體重增長緩慢,明顯輕于正常小鼠。C-K(14,28,

6、56 mg/kg)在d32時升高小鼠體重,C-K(14,28,56,112 mg/kg)在d35和d41使體重明顯恢復,C-K(112 mg/kg)在d50輕度升高小鼠體重。
　　CIA小鼠免疫以后,d24開始出現(xiàn)前爪和后爪紅腫,并伴有耳部紅斑、結(jié)節(jié),鼻出現(xiàn)結(jié)締組織等全身表現(xiàn)。d41開始C-K(112 mg/kg)對CIA小鼠全身表現(xiàn)評分有逐漸降低作用。
　　2.C-K對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹數(shù)的影響
　　d2

7、4,CIA組小鼠足爪出現(xiàn)較明顯紅腫逐漸加重。d45開始,C-K(112,56,28 mg/kg)先后降低CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù),C-K(7,14 mg/kg)不能明顯降低CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。
　　d43-d51,C-K(112 mg/kg)給藥組明顯降低升高了的CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù);d47-d51,C-K(56,112 mg/kg)明顯降低小鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù);d49-51,C-K(14,28,56,112 mg/kg)明顯降低CIA小

8、鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù),C-K(7 mg/kg)不能降低CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)。
　　3.C-K對CIA小鼠關(guān)節(jié)和脾臟病理變化的影響
　　CIA小鼠關(guān)節(jié)腔可見滑膜組織增生,襯覆多層滑膜細胞,炎性細胞浸潤,血管擴張充血,血管翳出現(xiàn),甚至出現(xiàn)骨和軟骨破壞。C-K(56 mg/kg)對骨質(zhì)侵蝕和血管翳的形成有輕度抑制作用;C-K(112 mg/kg)對骨質(zhì)侵蝕、血管翳、炎癥和滑膜細胞增殖均有不同程度的改善作用。
　　CIA小鼠脾臟可見白

9、髓增生,表現(xiàn)為藍染的淋巴細胞聚集區(qū)變大,生發(fā)中心出現(xiàn);紅髓增生,淤血,范圍增大。C-K(56 mg/kg)減少生發(fā)中心數(shù)量;C-K(112 mg/kg)顯著改善脾臟病理變化,對動脈周圍淋巴鞘的細胞密度、淋巴小結(jié)增生、邊緣區(qū)增生和生發(fā)中心數(shù)量有明顯抑制作用。
　　4.C-K對CIA小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響
　　與正常組相比,CIA小鼠胸腺和脾臟明顯腫大,指數(shù)增加。C-K(56,112 mg/kg)對脾臟指數(shù)有明顯抑制作用;C-

10、K各給藥組對胸腺指數(shù)沒有明顯影響。
　　5.C-K對CIA小鼠脾臟T、B淋巴細胞增反應的影響
　　與正常組相比,ConA誘導的CIA小鼠脾臟T淋巴細胞增殖反應及LPS誘導的CIA小鼠脾臟B淋巴細胞增殖明顯增強。C-K各劑量組均可顯著抑制ConA誘導的CIA小鼠脾臟T淋巴細胞增殖反應。C-K(28,56,112 mg/kg)能夠輕度抑制LPS誘導的CIA小鼠脾臟B淋巴細胞增殖。說明C-K對T細胞的作用強于對B細胞的作用,需要進

11、一步實驗闡述人參皂苷的作用機制。
　　6.C-K對CIA小鼠血清和踝關(guān)節(jié)勻漿細胞因子水平的影響
　　與正常組相比,CIA小鼠血清IgG1、IgG2a、抗II型膠原抗體和抗CCP抗體水平均明顯升高。C-K(28,56,112 mg/kg)顯著抑制IgG1水平;C-K(14,28,56,112 mg/kg)顯著降低血清IgG2a含量;C-K(56,112 mg/kg)對抗II型膠原抗體的產(chǎn)生有顯著抑制作用;C-K各給藥組對升高的

12、抗CCP抗體水平?jīng)]有明顯影響。
　　關(guān)節(jié)勻漿中OPG含量減少,TNF-α、IL-1β、IL-17和RANKL含量顯著增多。C-K(56,112 mg/kg)降低TNF-α和IL-1β水平,C-K(14,28,56,112 mg/kg)不同程度減低關(guān)節(jié)勻漿中IL-17濃度,C-K(28,56,112 mg/kg)可以升高OPG含量。C-K各組對RANKL的高表達沒有抑制作用。
　　7.C-K對CIA小鼠脾臟T、B細胞亞群的影響

13、
　　選取C-K(28,56,112,mg/kg)三組進一步探討C-K的作用機制。
　　與正常組比較,CIA組脾臟中未成熟 B細胞(CD19+IgM+)、成熟 B細胞(CD19+IgD+)、記憶B細胞(CD19+CD27+)的細胞百分含量增加,而調(diào)節(jié)性B細胞(CD19+CD5+CD1dhi)的細胞百分含量減少。C-K(28,56,112,mg/kg)三劑量組對B細胞各亞群比無明顯影響。
　　與正常組比較,CIA組脾臟中

14、總 Th細胞（CD3+CD4+)、活化 Th細胞(CD4+CD69+)、表達CD40L的活化T細胞(CD4+CD154+)和效應記憶性T細胞(CD4+CD62L-CD44hi)比例均顯著升高,未致敏Th細胞(CD4+CD62L+CD44low)和調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例顯著降低。C-K(28,56,112 mg/kg)三劑量組能夠不同程度的升高未致敏Th細胞和Treg細胞比例,降低活化Th細胞、表達CD40L的

15、活化T細胞和效應記憶性T細胞的比例,對總Th細胞比例無明顯影響。
　　8.C-K對CIA小鼠脾臟中TCR、CD28、CTLA-4、PD-1蛋白表達的影響
　　與正常組比較,CIA組脾臟中TCR、CD28蛋白表達增加,而CTLA-4、PD-1蛋白的表達降低。C-K(28,56,112 mg/kg)三劑量組能夠不同程度降低CIA小鼠脾臟中異常升高的共刺激因子TCR、CD28蛋白表達,同時,升高CIA小鼠脾臟中異常降低的共抑制因子