五種蟲媒病毒的傳代和鑒定以及生物學性狀和分子生物學特征的研究.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院碩士學位論文五種蟲媒病毒的傳代和鑒定以及生物學性狀和分子生物學特征的研究姓名：彭文明申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：黃如統(tǒng)2002.6.1五種蟲媒病毒的傳代鑒定及生物學與分子生物學性狀的研究 中文摘要清組。誣種蟲媒病毒的生物學實驗顯示，1 ～3 日齡乳鼠對這五種蟲媒病毒均敏感，但發(fā)病時間及癥狀有所不同。M A Y 發(fā)病時間約為1 ～2 d ，S F Vl d ，M V E3 d ，I L H2 d

2、，B U N1 ～2 d ．在細胞敏感性試驗中，采用微量細胞培養(yǎng)方法測定病毒的滴度，將不同稀釋度的鼠腦懸液分別接種于L L C - M K ：、B H K z - 、C 6 ／3 6和^ ，．，細胞，從五種病毒在這4 株傳代細胞上出現(xiàn)C P E 的時間來看，以在B H K ：。細胞上出現(xiàn)的最早、一般為2 —3 天；C P E 最明顯，M A Y 和S F V 為融合C P E ，而且滴度普遍較高，都在6 ．5 以上．空斑試驗對細胞的要求

3、較高，為了探索細胞培養(yǎng)的最佳條件，選擇血清含量、p H 值和卡那霉素濃度三個細胞培養(yǎng)的主要影響因素，按照L ，( 3 3 ) 正交設計對B H K ：，細胞培養(yǎng)進行三因素三水平試驗。結果表明，在6 0 ％D M E M ，3 0 ％的0 ．5 ％水解乳蛋白，1 0 ％小牛血清，常量青、鏈霉素和5 0 ¨g ／m l 卡那霉素，保持p H7 ．2 條件下，B H K ：，細胞生長最好，細胞單層能夠維持7 天以上．在該培養(yǎng)條件下，

4、五種病毒在B H K ，。細胞單層上于不同時間出現(xiàn)了形態(tài)、大小都不相同的空斑，最早出現(xiàn)空斑的時間為2 —3 天，最佳時間為3 ～4 天．其中SF V 出現(xiàn)了圓形直徑4 ．7 m m 的大空斑，M A Y 、IL H 和B u N 出現(xiàn)1 ．0 ～1 ．6 m m 的空斑，而M V E 僅為0 ．7 m m 的小空斑．隨后進行了病毒的血凝試驗，五種蟲媒病毒對鵝紅細胞的血凝最適p H 值分別為：M A Y 6 ．4 、S F V6 ．4 、

5、M V E7 ．0 、I L H6 ．6 和B U N6 ．4 。以上性狀均符合蟲媒病毒的生物學性質．在生物學性狀研究的基礎上，本文又從分子生物學水平對這五種蟲媒病毒進行了進一步的研究．首先從乳鼠腦中提取病毒基因組R N A ，利用逆轉錄一聚合酶鏈式反應( R T - P C R ) 技術進行五種蟲煤病毒部分結構區(qū)或非結構區(qū)中保守基因片段的c D N A 擴增，獲得的目的片段分別克隆于p G E M - T - E a s y 載體，挑