一維固相pH梯度等電聚焦與生物質譜聯(lián)用鑒定混合蛋白質的方法建立與應用.pdf

1、建立了一種基于一維固相pH梯度等電聚焦電泳(1DIPG-IEF)結合MALDI-TOF-MS，CapLC-Nanoflow-MS/MS和MALDI-TOF-TOF-MS鑒定混合蛋白質的方法。本研究考察了1DIPG-IEF的上樣量、染色方法、重復性和膠內酶切技術。詳細比較了5種染色方法的效果，B2法無“酸性端歧視效應”，脫色速度快，與質譜兼容，在功能蛋白質組學研究中有應用前景。優(yōu)化了IPG膠條的膠內酶切實驗技術。1DIPG-IEF比1DS

2、DSPAGE分離能力高，更適合鑒定蛋白質異構體。1DIPG-IEF也可無需酶切直接分析膠內蛋白質。 將上述方法用于人白血病細胞K562提取物的蛋白質鑒定，共鑒定出33個蛋白質。12個蛋白質與文獻報道相同。其中用MALDI-TOF-TOF-MS鑒定出18個蛋白質；用LC-MS/MS鑒定出16個蛋白質，平均由3～5個肽段(最多7個)鑒定一個蛋白質，具有較高可信度，適合分析較復雜蛋白質混合物。 用阿糖胞苷(Ara-c)誘導HL

3、-60細胞凋亡，用透射電鏡進行細胞形態(tài)學觀察。給藥6h后，HL-60細胞出現(xiàn)早期凋亡特征，24h后HL-60細胞進入凋亡中晚期。構建了HL-60細胞凋亡全過程的1DIPG-IEF差異表達圖譜。未經(jīng)Ara-c處理的HL-60細胞的IPG-IEF有49個條帶，經(jīng)Ara-c作用6、12、24、36h后條帶分別減少到30、29、29和28條，約減少40％，堿性蛋白條帶減少幅度大。差異蛋白條帶經(jīng)Denovo測序，鑒定了6個較重要蛋白質。其中組蛋白