Fos12和Leptin基因的克隆及其在豫南黑豬不同組織內表達規(guī)律的研究.pdf

1、Fosl2(Fos-like antigen2)屬于活化因子蛋白1(activator protein-1，AP1)轉錄因子家族中的一種，在多種組織中均有顯著表達，對哺乳動物的生長發(fā)育、生殖性狀、免疫應答等方面起到重要的作用。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Fosl2基因與脂肪代謝、骨骼發(fā)育以及疾病和癌癥的發(fā)生有著重要聯(lián)系;Leptin基因是人們最早發(fā)現(xiàn)的調節(jié)能量代謝的基因。本研究在實驗室前期工作的基礎上，以豫南黑豬為試驗材料，對Fos

2、l2和Leptin進行克隆測序及生物學信息分析，研究了豫南黑豬在不同發(fā)育時期及不同組織中的發(fā)育差異性表達，以期探索Fosl2和Leptin在豬不同發(fā)育階段中所起的作用，從基因角度闡明豫南黑豬的組織表達譜規(guī)律。根據(jù)NCBI中GenBank已經(jīng)公布的人、鼠、牛和大猩猩Fosl2的mRNA序列，利用計算機軟件DNAstar進行基因序列的同源性比對，找出不同物種之間Fosl2基因cDNA的保守區(qū)域后設計特異性引物，采用RT-PCR技術克隆基因，

3、利用克隆的堿基序列作為探針在NCBI中進行同源性比對，利用生物信息學軟件對兩種基因的氨基酸結構和序列特征進行分析和預測，采用實時熒光定量PCR方法在mRNA水平上檢測兩種基因在豫南黑豬不同生長發(fā)育時期中的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和背部脂肪組織中的表達變化和表達差異情況。通過上述方法得出如下試驗結果:
　　1、根據(jù)不同物種比對后得到的保守區(qū)域，設計特異性引物，采用RT-PCR方法從豫南黑豬胎衣中擴增出Fosl2基因部分cD

4、NA序列，從背部脂肪組織中擴增出Leptin基因部分cDNA序列，分別為1427 bp和253bp;其中Fosl2的CDS區(qū)域長度為984 bp。
　　2、根據(jù)1中所示方法在豫南黑豬的內臟器官中擴增該基因序列時，得到長度為770bp的Fosl2轉錄本。與胎衣中所得片段相比，該轉錄本第三外顯子后端缺失44個堿基序列，在第四外顯子的前端同樣有堿基缺失，長度為614 bp。
　　3、利用生物學信息軟件分析豫南黑豬Fosl2基因所得

5、序列與Leptin基因的CDS與多種物種的同源一致性，結果顯示:豬Fosl2基因序列與牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、獼猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、鼠(XM_004686333.1)、樹鼩(XM_006162129.1)、馬(XM_005600106.1)的核苷酸同源性分別為91％、89％、89％、89％、89％、88％、90％。而與上述物種的氨基酸一致性則

6、分別為:85％、86％、84％、85％、82％、83％、71％?？梢娫摶蛟诓煌锓N之間的保守性較高。Leptin基因與人(NM_000230.2)、牛(NM_173928.2)、鼠(NM_013076.3)、海豹(AJ618981.1)、海獅(AM157372.2)、犬(NM_001003070.1)、灰海豹(AJ618982.1)、小家鼠(NM_008493.3)、獼猴（NM_001042755.1）、家貓(NM_001009850

7、.1)等物種核苷酸同源性分別為88％、92％、85％、83％、87％、92％、83％、85％、88％、91％，而與上述物種的氨基酸一致性分別為97％、100％、94％、89％、87％、90％、92％、94％、97％、92％，該基因在哺乳動物間的保守型同樣較高。
　　4、通過實時熒光定量PCR技術檢測到豫南黑豬Fosl2基因在多種組織內廣泛表達，其中在7日齡、30日齡、60日齡和180日齡中肺臟組織中的相對表達含量雖有較大波動，但一

8、直維持在最高的相對表達水平，其次是在脾臟組織內的相對表達含量。而Leptin基因在180日齡中的脂肪組織內相對表達含量最高。
　　5、兩種基因在同一組織的不同發(fā)育時期的變化規(guī)律為:肺臟組織中Fosl2基因的mRNA變化幅度最大，7日齡肺臟、腎臟和脾臟內的相對表達含量為各個時期的最高值，30日齡的肌肉組織內相對表達含量最高，180日齡時心臟和背部脂肪內Fosl2基因的相對表達含量最高。Leptin基因在7日齡腎臟和肌肉內的相對表達量