甘蔗Rubisco和PEPC基因的克隆及其在不同施氮水平下不同甘蔗品種中的表達(dá).pdf

1、甘蔗（Saccharrum spp.）是一種重要的C4作物，在我國(guó)90％以上食糖年產(chǎn)量來(lái)自甘蔗。近年來(lái)，中國(guó)的甘蔗產(chǎn)業(yè)面臨著許多新的挑戰(zhàn)，過(guò)量施肥是其中之一。氮肥施用過(guò)量是國(guó)內(nèi)蔗區(qū)極為普遍的現(xiàn)象，施氮過(guò)量不僅導(dǎo)致氮利用效率下降，增加了生產(chǎn)成本，加重病蟲害，降低甘蔗蔗糖分，還會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境。光合酶Rubisco和PEPC是催化C4植物光合作用的關(guān)鍵酶，是植物葉片可溶性蛋白的主要組成成分，因此氮能夠通過(guò)影響這兩個(gè)酶的含量和酶學(xué)特性來(lái)影響光合

2、作用。雖然關(guān)于氮對(duì)光合作用影響的研究已有不少，但是氮對(duì)不同氮利用效率甘蔗品種光合作用影響的分子水平的研究鮮有報(bào)道。光合作用與氮素利用密切相關(guān)，研究不同施氮量對(duì)不同氮利用效率甘蔗品種光合作用的影響，闡明氮利用效率與光合作用互作的機(jī)理對(duì)提高氮肥的利用效率有重要意義。
　　本研究采用PCR技術(shù)擴(kuò)增甘蔗品種GT11的光合酶Rubisco和PEPC基因的全長(zhǎng)CDS序列，并進(jìn)行克隆、原核表達(dá)及純化。采用熒光定量和Westernblotting

3、技術(shù)對(duì)三個(gè)生長(zhǎng)于不同施氮水平下的氮利用效率不同的甘蔗品種(GT11、ROC22和GXB9)的光合酶基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定光合作用，所得結(jié)果如下:
　　1.成功克隆出GT11的光合酶基因rbcS、rbcL和pepc的全長(zhǎng)CDS，并在原核表達(dá)宿主Rosetta中進(jìn)行表達(dá)，最終獲得了符合單克隆抗體制備條件的融合蛋白SSU和LSU。
　　2.通過(guò)對(duì)熒光定量和Western blotting結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，氮利用效率高的甘蔗

4、品種GXB9的三個(gè)光合酶基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)量均比較穩(wěn)定，ROC22次之，而氮利用效率最低的甘蔗品種GT11基因表達(dá)波動(dòng)最為劇烈。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)施氮處理主要通過(guò)影響rbcS的表達(dá)來(lái)影響甘蔗的光合作用。
　　3.對(duì)葉片中光合酶蛋白的Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LSU在10月份時(shí)部分被降解為略小于全長(zhǎng)的肽段，這可能與甘蔗進(jìn)入成熟期凈光合速率降低有關(guān)。
　　4.在本研究條件下，施氮處理對(duì)甘蔗光合速率有明顯的影響，雖