維拉帕米誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、生理情況下，視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細(xì)胞是多角形、鑲嵌的單層細(xì)胞，呈極性排列，介于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間。作為血-視網(wǎng)膜外屏障，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和視功能[1,2]。RPE細(xì)胞頂部與視網(wǎng)膜外層的錐細(xì)胞和桿細(xì)胞相聯(lián)系，基底部與脈絡(luò)膜的Bruch膜緊密連接。RPE細(xì)胞是一靜止的單層細(xì)胞，當(dāng)體外培養(yǎng)或在損傷修復(fù)時(shí)，保持一種潛在的分化增殖能力[2,3]。RPE細(xì)胞受到一定刺激，如光凝固

2、或視網(wǎng)膜冷凍時(shí)，在體內(nèi)容易增殖[4,5]。輕微的損傷，如僅損傷RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞層時(shí)，RPE細(xì)胞迅速增殖并重新建立起連續(xù)單層的細(xì)胞[6]。然而在較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，如眼穿通傷和視網(wǎng)膜脫離時(shí)，RPE細(xì)胞可脫落在玻璃體中，在新的環(huán)境下，表現(xiàn)為分化增殖狀態(tài)，形成類似纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞，并保持增殖和遷移的能力，這些病理過程是早期增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)形成的重要原因[7]。雖然

3、RPE細(xì)胞是一靜止的單層細(xì)胞，但在體外培養(yǎng)時(shí)，則保持一種增殖、分化狀態(tài)，因此體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞常作為研究早期PVR的模型。 PVR是眼組織對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的一種過度增殖的結(jié)果[8]，RPE細(xì)胞的遷移、增殖可啟動(dòng)PVR的形成，并且對(duì)PVR疾病增殖膜形成具有重要作用，是PVR膜中的主要細(xì)胞成分。實(shí)驗(yàn)包括動(dòng)物模型及臨床檢查發(fā)現(xiàn)，PVR中的RPE細(xì)胞不僅失去原來(lái)的非增殖狀態(tài)，而且分化成類似巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞樣。正常成年人RPE細(xì)胞在原

4、位幾乎沒有增殖現(xiàn)象，然而在多種因素刺激下，RPE細(xì)胞脫離原位發(fā)生增殖，失去正常的接觸抑制作用，更顯著的變化是RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的RPE細(xì)胞不僅形態(tài)有異而且有高度運(yùn)動(dòng)性，能像巨噬細(xì)胞樣遷移，也具有平滑肌細(xì)胞樣收縮功能，并能像炎性細(xì)胞一樣產(chǎn)生炎癥趨化因子。正是轉(zhuǎn)化后的RPE細(xì)胞具有這些特殊功能，因此RPE細(xì)胞在PVR的發(fā)生發(fā)展中起到了極為重要作用。 目前臨床治療PVR疾病主要以玻璃體手術(shù)為主，盡管玻璃體手術(shù)的技術(shù)不斷提高，但PV

5、R復(fù)發(fā)率并未改善。因此在PVR形成的早期，應(yīng)用藥物或玻璃體手術(shù)聯(lián)合藥物抑制其發(fā)生、發(fā)展十分重要。RPE細(xì)胞是PVR形成的最重要細(xì)胞，抑制PVR關(guān)鍵就是阻止RPE細(xì)胞的增殖。近期有關(guān)PVR的研究熱點(diǎn)是借助細(xì)胞凋亡途徑控制RPE細(xì)胞的增殖，施加凋亡誘導(dǎo)劑，使遷移的RPE細(xì)胞發(fā)生凋亡，從根本上阻止PVR膜的形成和進(jìn)一步發(fā)展。柔紅霉素、H2O2、吲哚美辛、維甲酸、神經(jīng)酰胺等均可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞凋亡[9-13]，但引起RPE細(xì)胞凋亡的分子

6、機(jī)制不甚清楚。而且由于這些藥物的毒副作用，臨床應(yīng)用受限。維拉帕米(Verapamil，Ver)是一種可靠的鈣通道阻斷劑，廣泛應(yīng)用于臨床，且副作用小。本課題組前期應(yīng)用鈣離子通道阻斷劑-維拉帕米(Ver)已成功地誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞的凋亡。 但是其凋亡的分子機(jī)制、凋亡過程中涉及哪些信號(hào)還不甚清楚。 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指機(jī)體在生理?xiàng)l件下受到刺激后，經(jīng)過多種途徑的信號(hào)傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改

7、變而引起細(xì)胞自殺性死亡的過程，又叫程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)。但在不同環(huán)境、不同細(xì)胞或不同刺激的情況下，細(xì)胞凋亡的途徑又是不同的，因而細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有多樣性，這就使凋亡的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。隨著對(duì)凋亡信號(hào)系統(tǒng)越來(lái)越多的研究，人們認(rèn)識(shí)到凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是不同通路相互交織、各信號(hào)分子相互作用的過程，并構(gòu)成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。不同的基因、細(xì)胞因子以及一些蛋白酶都參與了凋亡的發(fā)生，如細(xì)胞

8、內(nèi)重要信使Ca2+，在許多細(xì)胞凋亡中充當(dāng)?shù)蛲鰡?dòng)信號(hào)；Bcl-2家族在凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)控著凋亡的發(fā)生和發(fā)展，并通過一定機(jī)制精密調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化；Caspases家族中的caspase-3是凋亡的發(fā)生的執(zhí)行者，作用凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最下游，受其上游信號(hào)Bcl-2家族的調(diào)控，同時(shí)caspase-3的激活，又以Bcl-2為底物，水解Bcl-2蛋白，從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。而caspase-8的激活也可通過細(xì)胞外途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

9、 我們前期應(yīng)用不同濃度的Ver作用體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ver能抑制RPE細(xì)胞增殖，而且80mg/L的Ver可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡。但凋亡過程中是Ca2+如何變化，Ca2+的變化是否啟動(dòng)凋亡抑制基因Bcl-2?凋亡過程中RPE細(xì)胞分泌的細(xì)胞保護(hù)性因子bFGF如何變化?以及caspases家族的關(guān)鍵成員caspase-8和caspase-3是否參與了凋亡發(fā)生?目前均不清楚?；谏鲜鲈?，我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上，對(duì)鈣通道阻斷劑Ver誘導(dǎo)

10、體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控的機(jī)制作進(jìn)一步的探討。 材料與方法：一、組織來(lái)源及準(zhǔn)備在元菌條件下，取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院眼科角膜移植取材后健康人供體眼，年齡24-38歲，離體時(shí)間4-12小時(shí)。 二、人RPE細(xì)胞原代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，采用胰蛋白酶消化法，分離RPE細(xì)胞，種植于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞80％-90％融合后，胰蛋白酶消化傳代，3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一、原代培養(yǎng)的RPE細(xì)胞為圓形、胞體

11、透亮、含較多黑色素顆粒。細(xì)胞貼壁后，變成扁平、不規(guī)則的多角形，可見清晰透明的圓形細(xì)胞核以及雙核細(xì)胞。傳代后，胞漿內(nèi)的黑色素顆粒逐漸減少。實(shí)驗(yàn)組貼壁細(xì)胞減少，多數(shù)呈多邊形。胞膜皺縮，胞漿內(nèi)可見空泡。正常RPE細(xì)胞Ca2+熒光分布結(jié)果顯示：胞核熒光最強(qiáng)，胞漿次之。Ver作用RPE細(xì)胞10s-10min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣熒光值無(wú)明顯變化。Ver作用12h，24h及48h后，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i(nmol/L)分別為176.09±25.88、156.

12、45±20.60、135.28±21.18，與對(duì)照組RPE細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i197.25±29.03比較，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯降低(P＜0.01)。 實(shí)驗(yàn)二、對(duì)照組RPE細(xì)胞可見Bcl-2的mRNA有較高表達(dá)。Ver作用12h后，Bcl-2的mRNA表達(dá)逐漸下降，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。隨著Ver作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl-2的mRNA表達(dá)明顯下降。Bcl-2與內(nèi)對(duì)照β-actinRT-PCR產(chǎn)物比值的平

13、均值分別為1.14±0.16、1.03±0.17、0.66±0.04及0.58±0.02(P＜0.05)。Ver作用12h時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。Ver作用24h、48h時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，與檢測(cè)Bcl-2的mRNA結(jié)果一致。 Ver作用后，RPE細(xì)胞bFGF的mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)。各組與內(nèi)對(duì)照比值為0.36±0.06、0.48±0.05、0.64±0.

14、05及0.81±0.09。組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)三、對(duì)照組RPE細(xì)胞可見caspase-3的mRNA及蛋白有少量的表達(dá)。Ver作用12h后，可見caspase-3的mRNA有較高的表達(dá)，與對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)。各組與內(nèi)對(duì)照比值為0.58±0.08、0.89±0.12、1.22±0.14及1.18±0.09，隨著Ver作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Caspase-3的mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在48h時(shí)有

15、所下降。蛋白印記法檢測(cè)caspase-3蛋白，正常RPE細(xì)胞有少量表達(dá)，Ver作用12h后，蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)。而在本實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)照組和Ver作用12h、24h、48h各組均未見有caspase-8的mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論：1.Ver誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度下降，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能是RPE細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)信號(hào)。 2.Ver誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞凋亡過程中，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的成分Bcl-2、