豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌TGF-β2的信號通路的研究.pdf

1、目的：
　　 在各種近視眼發(fā)病機制學說中,“視網(wǎng)膜局部調(diào)控學說”備受矚目,該學說認為視網(wǎng)膜感知外界環(huán)境變化后產(chǎn)生一級近視信號因子(如視黃酸,RA)并作用于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE),使之產(chǎn)生二級信號因子(如TGF-β2),進而調(diào)控鞏膜的生長,形成近視。
　　 本實驗觀察全反視黃酸(ATRA)對豚鼠RPE細胞的生長、分泌TGF-β2的影響及細胞內(nèi)第二信使cAMP、IP3的

2、變化。并研究磷脂酶C抑制劑U73122和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536分別對視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長及分泌TGF-β2影響,分析RPE細胞分泌TGF-β2的相關(guān)胞內(nèi)信號傳導途徑,進一步探討RPE在近視發(fā)生發(fā)展中的呈遞作用。
　　 方法：
　　 選取健康3周齡花色豚鼠,麻醉處死后摘取眼球,采用組織消化法分離培養(yǎng)豚鼠RPE細胞,上皮細胞特異的角蛋白免疫組化染色鑒定,取第2-3代對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。實驗細胞于使用前均

3、換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時以使其同步化。
　　 1.ATRA組:用MTT法檢測不同濃度(5×10-6M,10×10-6M,40×10-6M)ATRA對豚鼠RPE細胞增殖的影響。選取濃度為10×10-6M的ATRA作用于RPE細胞,分別于2h、4h、6h、8h、16h取上清培養(yǎng)液用ELISA方法檢測TGF-β2的分泌量；于0min、5min、30min、2h、6h收集細胞裂解液用ELISA和放射免疫的方法分別檢測胞內(nèi)cAMP和IP

4、3的含量變化。
　　 2.磷脂酶C抑制劑U73122和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536組:用MTT法檢測不同濃度(5×10-6M,10×10-6M,15×10-6M,20×10-6M)U73122和(5×10-6M,10×10-6M,20×10-6M,50×10-6M)SQ22536對豚鼠RPE細胞增殖的影響。取濃度為1×10-6M的U73122、SQ22536作用于豚鼠RPE細胞,分別于2h、4h、6h、8h、16h用ELIS

5、A方法檢測TGF-β2的分泌量。
　　 結(jié)果：
　　 1.RPE細胞原代培養(yǎng)及鑒定:
　　 原代培養(yǎng)的豚鼠RPE細胞48小時后已貼壁生長,細胞含有豐富的色素。傳代后色素減少,細胞近融合時形態(tài)近六角形。免疫組化角蛋白染色RPE細胞為棕黃色陽性反應。
　　 2.ATRA對豚鼠RPE細胞的影響
　　 MTT檢測:40×10-6M的ATRA作用RPE細胞24h后,細胞生長明顯受到抑制。5×10-6M和10

6、×10-6M的ATRA對RPE細胞的生長的作用與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。
　　 TGF-β2的檢測:加入10×10-6M ATRA后,TGF-β2的分泌量與對照組相比,2h、4h、6h明顯升高,8h無顯著差異,16h降低(P<0.05),呈隨時間延長分泌量逐漸下降趨勢。
　　 cAMP及IP3的檢測:加入含10×10-6M ATRA的培養(yǎng)液后,RPE胞內(nèi)cAMP含量在30min和2h時升高(p<0.05)

7、,5min、6h時與對照組相比無明顯差別。而胞內(nèi)的IP3含量在各時間點均顯著降低(p<0.05),6h時降低最明顯。
　　 3.磷脂酶C抑制劑U73122和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536對豚鼠RPE細胞的影響
　　 MTT檢測:5×10-6M濃度U73122作用豚鼠RPE細胞24h后,MTT結(jié)果與對照組無顯著差異(p>0.05),濃度>5×10-6M時均明顯低于對照組(p<0.01)。并隨濃度的增OD值降低越明顯。而S

8、Q22536組RPE細胞生長無明顯變化(p>0.05)。
　　 TGF-β2的檢測:加入1×10-5M U73122后,TGF-β2的分泌量除2h無顯著差異外,余各時間點均較對照組明顯增加(P<0.05)；而SQ22536組對RPE細胞分泌TGF-β2在2h,4h,6h,16h無明顯影響(p>0.05),8h時分泌量降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.較高濃度的ATRA及U73122對豚鼠RPE細胞的

9、增殖有抑制作用,而SQ22536對RPE細胞生長無明顯影響。
　　 2.10×10-6M的ATRA作用于RPE細胞后,TGF-β2的分泌量短期升高,隨時間延長而降低。
　　 3.10×10-6M的ATRA作用于RPE細胞后,IP3含量顯著降低,cAMP含量在觀察時間段中期有升高,后又降至對照組水平。
　　 4.U73122可使RPE細胞分泌TGF-β2增加,而SQ22536對RPE TGF-β2的分泌無明顯影響。