TPA誘導(dǎo)的橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞分化過程中生肌蛋白基因染色質(zhì)重塑機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文利用TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)對(duì)RD細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，并對(duì)其分化機(jī)制以及分化過程中早期分化標(biāo)志一生肌蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的重塑以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的結(jié)合進(jìn)行研究，為橫紋肌肉瘤的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 染色質(zhì)修飾酶通過對(duì)染色質(zhì)的修飾，對(duì)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整，促進(jìn)或阻遏轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Imu

2、noprecipitation，ChiP)分析是近些年發(fā)展起來檢測(cè)蛋白因子在體內(nèi)與染色質(zhì)的結(jié)合，進(jìn)而為蛋白因子參與染色質(zhì)水平基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供證據(jù)的方法。本研究運(yùn)用該方法，檢測(cè)了TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞分化過程中，肌細(xì)胞分化決定因子MyoD、染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF催化亞基BRGl、乙酰轉(zhuǎn)移酶p300和p300/CBP相關(guān)因子PCAF與生肌蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的結(jié)合情況。并應(yīng)用質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染及競(jìng)爭(zhēng)性RT-PeR的方法進(jìn)一步研究了PKC

3、、p38、PCAF、p300以及BRGl對(duì)生肌蛋白基因啟動(dòng)子活性的影響。 一、RD細(xì)胞分化過程中的相關(guān)信號(hào)途徑。 RD細(xì)胞，主要呈圓形和多邊形，少數(shù)紡錘形；而TPA誘導(dǎo)處理后，RD細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)典型的分化形態(tài)，如胞體伸長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒物增多，出現(xiàn)多核肌纖維類似結(jié)構(gòu)等(圖1)。與對(duì)照相比，TPA誘導(dǎo)分化的RD細(xì)胞，其生肌蛋白(骨骼肌早期分化標(biāo)心=kz)和肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain，骨骼肌晚期分化標(biāo)志)的

4、mRNA水平隨TPA作用時(shí)間的增加而增加(圖2)；而且生肌蛋白蛋白水平在24 h后表現(xiàn)明顯的升高，而肌球蛋白重鏈蛋白水平在TPA誘導(dǎo)48h后也表現(xiàn)明顯的增強(qiáng)(圖3)。提示TPA的誘導(dǎo)處理可能激活了生肌蛋白的完全表達(dá)，從而指導(dǎo)RD細(xì)胞重新進(jìn)入并完成分化。PKC抑制劑GF109203X的處理可抑制TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞生肌蛋白和肌球蛋白重鏈的蛋白表達(dá)量的升高(圖4)；p38抑制劑SB203580的處理，也可明顯抑制TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞分化過程

5、中生肌蛋白和肌球蛋白重鏈蛋白表達(dá)的增加以及mRNA水平的升高(圖5，6)。提示PKC與p38是TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞分化的必經(jīng)途徑。 二、RD細(xì)胞分化過程中染色質(zhì)調(diào)整蛋白及修飾因子與生肌蛋白基因啟動(dòng)子的結(jié)合分析。TPA能誘導(dǎo)RD細(xì)胞分化，表明RD細(xì)胞中存在行使SWI/SNF復(fù)合物功能所需的輔助因子。我們發(fā)現(xiàn)，橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞僅表達(dá)染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF的ATPase催化亞基BRGl，而不表達(dá)BRM(圖7)。 Ch

6、IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖8)，(1)未經(jīng)TPA誘導(dǎo)的對(duì)照RD細(xì)胞中，MyoD、p300均可結(jié)合到生肌蛋白基因啟動(dòng)子，而PCAF與BRG1在對(duì)照RD細(xì)胞中并不與生肌蛋白基因啟動(dòng)子結(jié)合。(2)在TPA誘導(dǎo)RD細(xì)胞分化6h后，PCAF開始結(jié)合于生肌蛋白基因啟動(dòng)子，而誘導(dǎo)12h后，BRG1開始與生肌蛋白基因啟動(dòng)子結(jié)合。p38抑制劑SB203580的處理，抑制BRG1與生肌蛋白基因啟動(dòng)子的結(jié)合，卻并不影響MyoD，D300以及TPA誘導(dǎo)的PCAF與生

7、肌蛋白基因啟動(dòng)子的結(jié)合。(3)RD細(xì)胞中MyoD呈非乙酰化狀態(tài)，在TPA誘導(dǎo)分化6h后MyoD開始被乙?；?圖9)。 三、RD細(xì)胞分化過程中染色質(zhì)調(diào)整蛋白及修飾因子對(duì)生肌蛋白基因啟動(dòng)子活性的影響。 (1)將含有報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒pREP4m-myog-CAT和轉(zhuǎn)染內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞之后加入TPA進(jìn)行誘導(dǎo)處理，啟動(dòng)子活性分析結(jié)果表明，TPA可以增強(qiáng)生肌蛋白基因的啟動(dòng)子活性，而SB203580的處理則抑制

8、TPA對(duì)生肌蛋白基因的誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)(圖14)，進(jìn)一步證實(shí)了p38是TPA激活生肌蛋白基因表達(dá)的必經(jīng)環(huán)節(jié)。 (2)PKCα表達(dá)質(zhì)?；騪38表達(dá)質(zhì)粒pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，啟動(dòng)子活性分析結(jié)果表明，PKCα可以增強(qiáng)生肌蛋白基因的啟動(dòng)子活性，但p38對(duì)其無效應(yīng)(圖15)，提示p38對(duì)生肌蛋白基因表達(dá)的激活還需要其它因子的參與。 (3)PCAF表達(dá)質(zhì)?；騪300表達(dá)質(zhì)粒與pREP4m-myo

9、g-CAT和pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞，啟動(dòng)子活性分析結(jié)果表明，PCAF可以增強(qiáng)生肌蛋白啟動(dòng)子的活性，但p300對(duì)生肌蛋白啟動(dòng)子無影響(圖16)。PCAF與p38(或其顯性負(fù)突變體)表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DN-p38抑制PCAF對(duì)生肌蛋白啟動(dòng)子活性的激活(IN 17)，表明PCAF在調(diào)節(jié)生肌蛋白基因的表達(dá)中可能依賴于p38的活性。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明TSA的處理可以促進(jìn)生肌蛋白基因的啟動(dòng)子活性(圖18)。 (4)BRG

10、1表達(dá)質(zhì)粒(或其顯性負(fù)突變體)與pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，進(jìn)行TPA誘導(dǎo)，啟動(dòng)子活性分析結(jié)果表明，BRG1不影響生肌蛋白基因的啟動(dòng)子活性，但能促進(jìn)TPA誘導(dǎo)的生肌蛋白基因啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)，而DN-BRG1則抑制TPA對(duì)生肌蛋白基因啟動(dòng)子活性的激活作用(圖19)。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，DN-BRG1也抑制PKCα和 PCAF對(duì)生肌蛋白基因啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)(圖20，21)。這些結(jié)果均表明BRG1對(duì)于生