染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基hSNF5結(jié)合蛋白hNOP17的鑒定及功能初步研究.pdf

1、染色質(zhì)的形成經(jīng)過多層次包裝，同時具有動態(tài)結(jié)構(gòu)，使其既能以適合真核細(xì)胞核大小的包裝形式存在，又能作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、損傷修復(fù)。在這種動態(tài)結(jié)構(gòu)中起重要作用的酶包括染色質(zhì)重塑和修飾酶。ATP依賴性染色質(zhì)重塑復(fù)合物是重要的染色質(zhì)重塑酶，包括四個亞家族：SW12/SNF2、Mi-2/CHD、ISWI、IN080/SWR1。SWI2/SNF2是最早在酵母中發(fā)現(xiàn)的ATP依賴性染色質(zhì)重塑復(fù)合物。人類具有同源的SWI/SNF復(fù)合物，具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄

2、抑制的雙重作用，具體功能根據(jù)所調(diào)節(jié)的基因及復(fù)合物的組成的不同而不同。SWI/SNF復(fù)合物通過與不同蛋白因子相互作用，是整合多種傳導(dǎo)到細(xì)胞核的酶的級聯(lián)信號通路的理想平臺。人類SWI/SNF復(fù)合物中高度保守的亞基除了ATP酶亞基BRG1/BRM外，INI1/SNF5是基本亞基之一，存在于所有SWI/SNF復(fù)合物中。INI1/SNF5的功能包括通過蛋白的相互作用，募集SWI/SNF復(fù)合物到基因的啟動子區(qū)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。INI1/SNF5具有調(diào)節(jié)細(xì)胞

3、周期進(jìn)程及腫瘤抑制功能，目前研究較多的是其在p53/p21CIP/WAF1及p16INK4a/cyclinD/Rb/E2F通路中的作用。我們的早期研究是以hSNF5為誘餌，通過酵母雙雜系統(tǒng)，在人胎腦cDNA文庫中篩選得到五個可能的hSNF5結(jié)合蛋白。在此，我們對其中一個蛋白hNOP17與hSNF5的結(jié)合進(jìn)行了驗(yàn)證，并對其功能進(jìn)行了初步探討。所獲得的結(jié)果為INI1/SNF5的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供了新的線索： 1．通過PCR

4、，在人胎腦cDNA文庫中得到hNOP17全長cDNA片段。構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)GST-hNOP17融合蛋白并親和純化。通GST-pull dowm證明GST-hNOP17能夠與真核細(xì)胞全抽提物中的hSNF5共沉淀，提示在體外實(shí)驗(yàn)中hNOP17能與hSNF5結(jié)合。 2．構(gòu)建hNOP17真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。在293T細(xì)胞內(nèi)共同過表達(dá)FLAG-hNOP17及Myc-hSNF5，用標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫共沉

5、淀實(shí)驗(yàn)，證明FLAG-hNOP17能與Myc-hSNF5共沉淀，提供了hNOP17與hSNF5結(jié)合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 3．根據(jù)氨基酸殘基序列，預(yù)測hNOP17蛋白功能結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)域連接區(qū)并據(jù)此構(gòu)建了hNOP17的不同刪切片段的真核表達(dá)質(zhì)粒，在293T細(xì)胞內(nèi)與hSNF5共同過表達(dá)，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hNOP17 C木端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)及N術(shù)端的1-56個氨基酸殘基是hNOP17與hSNF5結(jié)合的重要區(qū)域。對hSNF5 C末端進(jìn)行刪切

6、，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)hSNF5 C術(shù)端是與hNOP17結(jié)合的重要區(qū)域，具體結(jié)合區(qū)域有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。 4．鑒于hNOP17是一種功能未知的蛋白，因此，以<'32p標(biāo)記的hNOPl7cDNA為探針雜交包括12種組織mRNA的多組織膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hNOP17在12種組織內(nèi)廣泛分布，并且在骨骼肌、腦、腎臟、肝臟、胎盤中表達(dá)水平較高。 5．在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)hNOP17并純化包涵體，制備hNOP17的兔多克隆抗

7、血清，Westem-blot結(jié)果顯示抗血清檢測效果特異。 6．構(gòu)建紅色熒光標(biāo)簽的hNOP17真核表達(dá)質(zhì)粒，與Myc-hSNF5共同在293T細(xì)胞中過表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)證明hNOP17與hSNF5在細(xì)胞內(nèi)共定位。用hNOP17的兔多克隆抗血清及Myc抗體免疫熒光染色hNOP17及Myc-hSNF5，結(jié)果證明hNOP17與hSNF5共定位于細(xì)胞核。用hNOP17的兔多克隆抗血清免疫熒光染色神經(jīng)源性的SH-SY5Y細(xì)胞及骨

8、骼肌源性的RD細(xì)胞提示內(nèi)源性hNOP17主要分布于細(xì)胞核。 7．通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)hSNF5對p21CIP/WAF1啟動子有轉(zhuǎn)錄激活作用，hNOP17對p21啟動子有抑制作用并且這種抑制作用可以被hNOP17 RNAi去除。共同表達(dá)hSNF5及hNOP17，hNOP17能夠抑制hSNF5對p21CIP/WAF1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。提示hNOP17與hSNF5在功能上有重要聯(lián)系。 作為一種新的hSNF5結(jié)合