用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選靶向PAI-1 mRNA的反義核酸及siRNA.pdf

1、隨著人們生活水平的提高和世界人口的老齡化，心血管疾病特別是血栓性疾病已成為威脅人類健康和生命的重要疾病。血栓性疾病包括急性心肌梗塞、缺血性腦血管病、肺栓塞以及各種動靜脈血栓等，每年可導致全世界大約2600萬人死亡。統(tǒng)計資料顯示，在我國血栓性疾病的每年發(fā)病人數(shù)達1000萬，其中病死人數(shù)100萬，至少有300萬人次需要溶栓藥物進行治療，是一類高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率疾病。盡管已有的第一代、特別是第二、三代溶栓藥物在臨床治療中已經(jīng)發(fā)揮了重

2、要的作用，但其存在各自的局限性，仍不能降低居高不下的血栓性疾病的發(fā)病率和致死率，因此研究和開發(fā)新型、高效的溶栓藥物具有重要意義。 PAI-1(Plasminogenactivatorinhibitor，PAI-1)是纖溶系統(tǒng)的重要組成成分，其主要生理功能是通過抑制t-PA和u-PA來調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的動態(tài)平衡，是纖溶系統(tǒng)的負調(diào)控因子。大規(guī)模流行病學調(diào)查和臨床研究表明，PAI-1升高是形成冠心病和心肌梗塞等血栓性疾病的一個獨

3、立危險因素，是血栓前狀態(tài)的重要分子標志物，而且與其他動脈粥樣硬化危險因素如肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗、糖尿病等密切相關(guān)。以PAI-1作為靶基因，為心血管疾病特別是血栓性疾病的防治提供了一條新的思路，從抑制PAI-1表達入手有可能研制出新型抗栓、溶栓藥物。而反義技術(shù)為心血管疾病特別是血栓性疾病的防治提供了新的技術(shù)平臺。 可用于抑制基因表達的反義技術(shù)包括三類：反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASON

4、s)，包括反義脫氧寡核苷酸(ASODNs)和反義RNA；具有催化活性的核酶(ribozymes)及DNA酶(DNAzymes)；小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。其基本原理是，根據(jù)堿基互補配對規(guī)律設(shè)計出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的RNA或DNA片段，通過各種機制使其降解或抑制其編碼蛋白的翻譯，從而抑制目的基因的表達。反義技術(shù)為基因組學研究以及新型基因藥物靶標的篩選提供了全新的策略并展示了廣闊的前景。

5、 RNA是研發(fā)基因藥物的理想分子靶標，mRNA結(jié)構(gòu)靶點篩選是研發(fā)反義mRNA基因藥物的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用以PAI-1為靶基因，應(yīng)用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)：即主要通過克隆PAI-1全長基因、體外轉(zhuǎn)錄為mRNA、與寡核苷酸庫雜交、芯片雜交及原位RNaseH切割的方法，進行mRNA結(jié)構(gòu)靶點篩選，篩選出靶向PAI-1mRNA反義核酸有效序列；在此基礎(chǔ)上設(shè)計、合成有高潛在活性的siRNA，在細胞水平進行驗證并探討其溶栓作用機制研究。本課題對新型溶栓基因治

6、療藥物的篩選具有重要的理論價值和現(xiàn)實指導意義。 實驗分以下二個部分：1.應(yīng)用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選靶向PAI-1mRNA的ASODN有效序列；2.靶向PAI-1mRNAsiRNA有效序列的篩選與細胞學驗證。 1.應(yīng)用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選靶向PAI-1mRNA的ASODN有效序列首先應(yīng)用RT-PCR方法克隆PAI-1全長基因，體外轉(zhuǎn)錄大量mRNA；將合成的單鏈寡核苷酸庫與mRNA進行雜交，經(jīng)洗脫、PCR擴增、克隆及測序，獲得

7、一系列與靶基因結(jié)合的位點；在對這些位點進行生物信息學分析的基礎(chǔ)上，找到與靶基因的熱點結(jié)合部位；根據(jù)這些熱點結(jié)合部位設(shè)計探針21條，在基因芯片上進行再篩選和優(yōu)化；綜合篩庫和芯片雜交結(jié)果，合成15條硫代修飾的反義寡核苷酸，在細胞水平進行驗證。以脂質(zhì)體將其分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48h，在反義核酸濃度為1.0μM/L時，15條反義序列中有14條(93％)能明顯降低PAI-1Ag水平(P＜0.05)。在

8、此基礎(chǔ)上，我們挑選5條作用明顯的有效序列(4＃、5＃、7＃、8＃、10＃ASODN)進一步研究表明，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義核酸濃度在0.1，0.25，0.5，1.0μM/L時，該5條ASODN可有效抑制PAI-1mRNA表達、Ag水平及活性，且呈劑量依賴性。 上述結(jié)果提示，應(yīng)用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)可以同時在全長基因范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)熱點靶位，而且理論上，遺漏最佳位點的可能性小，實現(xiàn)了對ASODN最佳結(jié)合位點的高通量篩選；靶向PAI-1mRNA的AS

9、ODN可通過抑制PAI-1mRNA翻譯成蛋白質(zhì)而降低了PAI-1Ag水平和活性，該作用機制與傳統(tǒng)的溶栓藥物及目前從蛋白水平抑制PAI-1的溶栓藥物作用機制有根本不同，因此有望成為心血管疾病特別是血栓性疾病治療的一種新型侯選溶栓反義藥物。 2.靶向PAI-1mRNAsiRNA有效序列的篩選與細胞學驗證。通過全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)，獲得了5條反義有效序列。在此基礎(chǔ)上，合成2條(5＃、10＃)有潛在高活性的與靶mRNA互補的siRNA，與載

10、體連接構(gòu)建siRNA表達質(zhì)粒，應(yīng)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEC，觀察siRNA對血管內(nèi)皮細胞PAI-1mRNA表達、Ag水平和活性的抑制作用。實驗結(jié)果顯示，siRNA對PAI-1mRNA表達、Ag和活性有明顯的抑制作用。PAI-1-siRNA濃度在1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml范圍內(nèi)，可有效抑制PAI-1mRNA，Ag表達及活性，呈劑量依賴性。 上述結(jié)果提示，應(yīng)用全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)篩選出的反義位點設(shè)計的反義寡核

11、苷酸(ASODN)的最佳結(jié)合位點與siRNA的作用位點有很好的相關(guān)性，反義寡核苷酸(ASODN)的最佳結(jié)合位點可能就是高活性siRNA的作用位點；本課題設(shè)計的siRNA不僅與PAI-1mRNA的堿基互補，而且是經(jīng)過最佳反義結(jié)合位點的篩選進行定向設(shè)計的，其特異性和有效性是預測的；靶向PAI-1siRNA有效序列對血管內(nèi)皮細胞PAI-1表達和活性有明顯的抑制作用，其機制與高效、特異引起轉(zhuǎn)錄后PAI-1基因沉默有關(guān)；與現(xiàn)有的基因治療藥物相比，

12、siRNA具有治療理論新穎、藥效特異、作用時間長等特色，并且siRNA為內(nèi)源性活性物質(zhì)，安全性好，靶向PAI-1siRNA有效序列有望成為新型溶栓基因藥物。 綜述以上工作，通過全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)，篩選出5條靶向PAI-1mRNAASODN有效序列，為堿基序列特異性的反義機制，ASODN通過抑制PAI-1mRNA表達而降低PAI-1Ag水平和活性，從而產(chǎn)生抗栓溶/栓活性，是一種有希望的不同于傳統(tǒng)溶栓藥物作用機制的新型溶栓侯選反義藥物