膽紅素對離體培養(yǎng)新生大鼠耳蝸組織毒性作用研究.pdf

1、黃疸是新生兒比較常見的現(xiàn)象，一般不會造成病理損害，但是當(dāng)血液中膽紅素過度升高時(shí)就會影響健康并導(dǎo)致一系列的神經(jīng)功能紊亂，其中聽力障礙是最常見的新生兒高膽紅素血癥后遺癥。多中心流行病學(xué)調(diào)查表明，聽神經(jīng)病與嬰幼兒時(shí)期發(fā)生高膽紅素血癥有極強(qiáng)的相關(guān)性，但膽紅素引起聽神經(jīng)病的具體機(jī)制還不是很清楚。為了更直觀的揭示膽紅素對外周聽覺器官的毒性作用部位，本研究對體外培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸基底膜組織及螺旋神經(jīng)節(jié)進(jìn)行了膽紅素處理，并觀察不同濃度的膽紅素以及同一濃

2、度不同作用時(shí)長下其各個部位毒性效應(yīng)。本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 不同膽紅素濃度對大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng)
　　目的:觀察不同濃度膽紅素對離體培養(yǎng)大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng)
　　方法:健康新生3日齡SD大鼠25只，雌雄不限，分離其雙側(cè)的內(nèi)耳，共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織50個。體外培養(yǎng)12h后換含5％F BS培養(yǎng)基；取材后48h，倒置顯微鏡觀察，選擇狀態(tài)良好、有成纖維爬出的基底膜40個入選實(shí)驗(yàn)，并

3、將其隨機(jī)分為4組：對照組；實(shí)驗(yàn)組：10μmol/L組，50μmol/L組，100μmol/L組，每組各10個標(biāo)本。分組完畢后開始進(jìn)行藥物處理,試驗(yàn)組每個細(xì)胞培養(yǎng)皿中按分組濃度加入膽紅素溶液，對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。所有的標(biāo)本均在藥物處理后24h終止培養(yǎng)并對其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色,共聚焦顯微鏡觀察。
　　結(jié)果:10μmol/L的膽紅素對離體培養(yǎng)的耳蝸組織作用24h時(shí)無明顯毒性作用，50μmol/L膽紅素組中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)

4、元有明顯減少，內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量完整；100μmol/L組中耳蝸組織的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元幾乎完全消失，內(nèi)、外毛細(xì)胞也都發(fā)生了損傷。
　　結(jié)論:膽紅素對耳蝸組織的損傷效應(yīng)呈濃度依賴性，且膽紅素首先損害的部位是螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增大時(shí)，毛細(xì)胞也會受到損傷。
　　第二部分 耳蝸組織受損效應(yīng)與膽紅素作用時(shí)間的關(guān)系
　　目的：觀察膽紅素對離體培養(yǎng)的新生SD大鼠耳蝸組織損傷的的時(shí)間依賴性
　　方法：健康新生3日

5、齡SD大鼠35只，雌雄不限，分離每組動物的內(nèi)耳共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸組織70個，原代取材培養(yǎng)12h后換含5%F BS培養(yǎng)基；取材后48h，觀察組織貼壁、存活良好的60個耳蝸組織入選實(shí)驗(yàn)，并將所有組織隨機(jī)分為六組：24h對照組，24h膽紅素組，48h對照組，48 h膽紅素組，72 h對照組，72h膽紅素組（每組各10個）；試驗(yàn)組每個細(xì)胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μmol/L，對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。三個試驗(yàn)組分別用藥24h、4

6、8 h、72 h終止培養(yǎng)，對照組亦分別在上述時(shí)間點(diǎn)取樣，并對其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色，之后共聚焦顯微鏡觀察耳蝸組織中毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)變化并計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)對比。
　　結(jié)果：膽紅素作用24h時(shí)，離體培養(yǎng)的耳蝸組織中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體及其樹突纖維即有明顯的減少，內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量完整；隨著膽紅素作用時(shí)間的延長，48 h時(shí)神經(jīng)元減少更加明顯，底回的外毛細(xì)胞開始出現(xiàn)缺失；72h時(shí)神經(jīng)元幾乎消失殆盡，底回及中回外毛細(xì)胞減少明

7、顯，底回內(nèi)毛細(xì)胞也發(fā)生了數(shù)量的減少。同時(shí)我們觀察到，三個時(shí)間點(diǎn)的對照組之間無明顯差異。在同樣的膽紅素作用時(shí)長下（24 h），當(dāng)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元已經(jīng)發(fā)生明顯的數(shù)量下降時(shí)，內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)量缺失不明顯，這說明毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元相比，其對膽紅素的毒性相對不敏感；但隨著膽紅素作用時(shí)間的延長（48 h及72 h），毛細(xì)胞也會受到損傷，并且外毛細(xì)胞首先出現(xiàn)缺失，內(nèi)毛細(xì)胞相對更能耐受膽紅素毒性。
　　結(jié)論：1.膽紅素對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷作

8、用具有時(shí)間依賴性；2.螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元比內(nèi)外毛細(xì)胞對膽紅素的毒性作用敏感。
　　第三部分 膽紅素作用下螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元cas pas e-3的表達(dá)及其凋亡過程觀察
　　目的：探討膽紅素對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性作用方式
　　方法：健康新生3日齡SD大鼠23只，雌雄不限，分離內(nèi)耳組織共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織46個，原代取材培養(yǎng)12h后換含5%F BS培養(yǎng)基；取材后48h，觀察組織貼壁、存活良好的40個耳蝸組織

9、入選實(shí)驗(yàn)，并將所有組織隨機(jī)分為四組：12h對照組，12h藥物組，24 h藥物組，48 h藥物組（每組各10個）；分組完畢后開始進(jìn)行藥物處理,試驗(yàn)組每個細(xì)胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μ mol/L，對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。各組分別在用藥12h、18 h、36 h終止培養(yǎng)，并對其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色、對比，之后共聚焦顯微鏡觀察螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中caspase-3的表達(dá)情況及胞體形態(tài)變化。
　　結(jié)果：膽紅素作用12h時(shí)cas