胺基胍對(duì)新生大鼠缺氧缺血所致耳蝸損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemicencephalopathy，HIE)是臨床工作中常見(jiàn)的圍產(chǎn)期新生兒因缺氧缺血引起的腦損傷疾病，缺氧缺血是影響聽(tīng)力發(fā)育的重要因素，其中耳蝸聽(tīng)毛細(xì)胞對(duì)缺氧缺血尤為敏感，患兒多可引發(fā)感音神經(jīng)性聾(sensorineuraldeafness)。但是，目前尚無(wú)有效的治療方法。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道認(rèn)為NO、NOS在致缺氧缺血新生大鼠耳蝸損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。在缺氧缺血所致其它疾病的

2、有關(guān)報(bào)道中，已有研究表明，胺基胍作為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制劑，可能對(duì)這些疾病具有治療和保護(hù)作用。但是胺基胍用于治療HIE引起的聽(tīng)力損傷國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此，為探討一氧化氮合酶抑制劑胺基胍(AG)是否對(duì)缺氧缺血所致的耳蝸損傷具有保護(hù)作用，本研究在建立新生大鼠HIE模型的基礎(chǔ)上，用iNOS抑制劑胺基胍來(lái)對(duì)缺氧缺血新生大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察新生大鼠的聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位(ABR)的變化，檢測(cè)血清中NO含量和耳蝸中iNOS、半

3、胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的表達(dá)，進(jìn)而探討胺基胍對(duì)缺氧缺血新生大鼠耳蝸損傷的保護(hù)機(jī)理，以期為臨床治療缺氧缺血導(dǎo)致的耳蝸損傷提供相關(guān)理論依據(jù)，從而提高HIE患兒的生存率和生活質(zhì)量。 方法：1.選用耳廓反射靈敏，體重在9～20g的健康新生7日齡Wistar大鼠192只，雌雄不限，無(wú)耳毒性藥物使用史，隨機(jī)分為四組：正常組，假手術(shù)組，缺氧缺血組和胺基胍組，每組48只。各組隨機(jī)分為6h、24h、48h、72h組，每組12只，

4、分別在造模后6h、24h、48h、72h進(jìn)行觀察測(cè)定。 2.HIE模型采用經(jīng)典Rice法，胺基胍組在造模后6h、24h、48h、72h，按照100mg/kg、Bid通過(guò)腹腔注射給予胺基胍。假手術(shù)組則只分離頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，也不置于低氧容器。正常不做任何處理。 3.各組動(dòng)物除留2只做腦組織HE染色病理觀察外，其余均于處死前使用美國(guó)AUDIT-V腦干誘發(fā)電位儀測(cè)試聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位(ABR)。 4.測(cè)試完畢后行心腔穿刺

5、采血，心內(nèi)灌注，然后立即取耳蝸組織，進(jìn)行耳蝸標(biāo)本HE染色病理觀察，測(cè)定血清中NO濃度。免疫組化染色觀察各組耳蝸組織iNOS、Caspase-3的表達(dá)情況，免疫組化染色的結(jié)果采用電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析。 5.應(yīng)用Excel2000對(duì)全部結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步比較用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果：1.新生大鼠分別在6h、24h、

6、48h、72h時(shí)，假手術(shù)組與正常組相比，ABR閾值，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅱ-Ⅲ波間期無(wú)明顯變化，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；缺氧缺血組和胺基胍組與正常組相比，ABR閾值升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅱ-Ⅲ波間期均延長(zhǎng)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；胺基胍6h組、24h組與缺氧缺血6h組、24h組相比，ABR閾值，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅱ-Ⅲ波間期，無(wú)明顯變化，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胺基胍48h組、72h組與缺氧缺

7、血48h組、72h組相比，ABR閾值降低，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潛伏期和Ⅱ-Ⅲ波間期縮短，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.光鏡下缺氧缺血6h、24h、48h、72h組均可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞水腫，隨著缺氧缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞水腫程度明顯，還可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，變性，細(xì)胞間距增大。而正常組和假手術(shù)組無(wú)此改變。與缺氧缺血各時(shí)段相比，胺基胍組上述改變明顯減輕。 3.正常組及假手術(shù)組耳蝸的外毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)損傷，血管紋清晰。缺氧缺

8、血組和胺基胍組在6h、24h外毛細(xì)胞倒伏，出現(xiàn)變形；缺氧缺血48h組外毛細(xì)胞散在缺失，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間距增大；缺氧缺血72h組外毛細(xì)胞損傷加重，出現(xiàn)片狀缺損，血管紋變薄，內(nèi)毛細(xì)胞和蓋膜未見(jiàn)明顯變化。胺基胍48h、72h組比缺氧缺血48h、72h組較上述表現(xiàn)減輕。 4.正常組、假手術(shù)組、缺氧缺血組和胺基胍組新生大鼠血清NO的含量分別為9.919±7.340ng/ml、8.914±5.071ng/ml、40.952±20.228ng

9、/ml、23.169±11.937ng/ml，四組之間血清NO含量存在差別，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步作兩兩比較，正常組與假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；缺氧缺血組與正常組、假手術(shù)組、胺基胍組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；胺基胍組與正常組、假手術(shù)組、缺氧缺血組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 5.iNOS免疫組化結(jié)果顯示正常組和假手術(shù)組iNOS在耳蝸血管紋，內(nèi)、外毛細(xì)胞，螺旋

10、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，新生大鼠分別在6h、24h、48h、72h時(shí)，缺氧缺血組和胺基胍組與正常組相比灰度值大，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；胺基胍6h組、24h組與缺氧缺血6h組、24h組相比灰度值無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胺基胍48h組、72h組與缺氧缺血48h組、72h組相比灰度值小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 6.Caspase-3免疫組化結(jié)果顯示正常組和假手術(shù)組Caspase-

11、3在耳蝸血管紋，內(nèi)、外毛細(xì)胞，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的弱陽(yáng)性表達(dá)，二者相比灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；新生大鼠分別在6h、24h、48h、72h時(shí)，缺氧缺血組和胺基胍組與正常組相比灰度值大，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；胺基胍6h組、24h組與缺氧缺血6h組、24h組相比灰度值無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胺基胍48h組、72h組與缺氧缺血48h組、72h組相比灰度值小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0