抗帕Ⅰ號方劑治療帕金森病機(jī)制的實驗研究.pdf

1、第一部分：抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠行為學(xué)的影響 目的：觀察抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠行為學(xué)的影響。 方法：6-羥基多巴胺(6-OHDA)損毀制備偏側(cè)帕金森病(PD)大鼠模型。PD大鼠分為4組，分別進(jìn)行抗帕Ⅰ號方劑(PDⅠ方劑組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼(美多巴組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼/抗帕Ⅰ號方劑(混合組)和生理鹽水(對照組)灌胃治療28天，觀察大鼠行為學(xué)變化，進(jìn)行不自主運動(AIM)進(jìn)行評分。 結(jié)果：抗帕Ⅰ號

2、方劑聯(lián)合美多巴治療，使PD大鼠產(chǎn)生穩(wěn)定的對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，減少AIM的發(fā)生。美多巴治療后，使PD大鼠產(chǎn)生不穩(wěn)定對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，第3周達(dá)高峰；并使PD大鼠在鹽酸去水嗎啡誘發(fā)后產(chǎn)生逐步增加的對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。抗帕Ⅰ號方劑聯(lián)合美多巴治療可使鹽酸去水嗎啡誘發(fā)的對側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少。 結(jié)論：抗帕Ⅰ號方劑聯(lián)合美多巴治療可改善PD大鼠癥狀，在一定程度上減少不自主運動的發(fā)生，減少美多巴用量，減輕美多巴的副作用。 第二部分：抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠黑

3、質(zhì)多巴胺神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及紋狀體單胺類遞質(zhì)的影響 目的：探討抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元存活率的影響及對紋狀體單胺類遞質(zhì)(多巴胺(DA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA))的影響。 方法：6-羥基多巴胺損毀制備偏側(cè)帕金森病大鼠模型。PD大鼠分為4組，分別進(jìn)行抗帕Ⅰ號方劑(PDⅠ方劑組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼(美多巴組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼/抗帕Ⅰ號方劑(混合組)和生理鹽水(對照組)灌胃治

4、療28天。酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學(xué)法檢測損毀側(cè)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的存活率；采用高壓液相色譜-熒光法(HPLC-FL)測定紋狀體DA及代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA的含量。 結(jié)果：各組損毀側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目均較對側(cè)明顯減少(P＜0.05)，治療后各組組間損毀側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目無明顯差異(P＞0.05)。與對側(cè)比較，各組損毀側(cè)紋狀體單胺類遞質(zhì)含量顯著下降。其中，對照組損毀側(cè)紋狀體DA下降了52.7％(P＜0.05)

5、；DOPAC下降了63.9％(P＜0.05)；HVA下降了54.8％(P＜0.05)。單純以抗帕Ⅰ號方劑治療后，損毀側(cè)紋狀體單胺類遞質(zhì)含量與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。經(jīng)美多巴及聯(lián)合用藥治療后，損毀側(cè)紋狀體單胺類遞質(zhì)含量較對照組、PDⅠ方劑組均顯著增加(P＜0.05)。 結(jié)論：抗帕Ⅰ號方劑治療PD時，PD大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元存活率并不優(yōu)于其他組；但抗帕Ⅰ號方劑可協(xié)同美多巴增加腦內(nèi)DA的含量，提高美多巴的

6、療效，可減少美多巴的用量，減輕美多巴的副作用。 第三部分：抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠基底節(jié)環(huán)路活動的影響 目的：研究抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠基底節(jié)環(huán)路活動的影響，即：①研究抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠損毀側(cè)紋狀體多巴胺D1(DR1)、D2受體(DR2)表達(dá)的影響以及探討抗帕Ⅰ號方劑是否有受體激動劑的作用；②研究抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠基底節(jié)區(qū)氨基酸遞質(zhì)(谷氨酸(glutamate,Glu)；天門冬氨酸(aspartic

7、acid,Asp)；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA))水平的影響；③研究抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠損毀側(cè)紋狀體a前速激肽原(preprotachykinin,a-PPT)、前強啡肽原(prodynorphin，PDyn)、前腦啡肽原(preproenkephalin,PPE)表達(dá)的影響。 方法：6-OHDA損毀制備偏側(cè)帕金森病大鼠模型。PD大鼠分為4組，分別進(jìn)行抗帕Ⅰ號方劑(PDⅠ方劑組)、左旋多巴甲酯/

8、芐絲肼(美多巴組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼/抗帕Ⅰ號方劑(混合組)和生理鹽水(對照組)灌胃治療28天。RT-PCR檢測損毀側(cè)紋狀體DR1、DR2受體的表達(dá)；用在體微透析技術(shù)收集基底節(jié)區(qū)細(xì)胞外液，用高效液相色譜法(HPLC)測定基底節(jié)區(qū)細(xì)胞外液中Glu、Asp、GABA的含量；RT-PCR檢測損毀側(cè)紋狀體a前速激肽原；原位雜交檢測損毀側(cè)紋狀體前強啡肽原、前腦啡肽原表達(dá)。 結(jié)果：①PDⅠ方劑組與對照組DR1mRNA、DR2mRNA表達(dá)

9、無顯著差異(P＞0.05)；美多巴組及混合組損毀側(cè)紋狀體區(qū)DR1mRNA表達(dá)較對照組、PDⅠ方劑組增強(P＜0.05)，而DR2mRNA表達(dá)較對照組、PDⅠ方劑組減弱(P＜0.05)。②單純以抗帕Ⅰ號方劑治療后，損毀側(cè)基底節(jié)區(qū)氨基酸遞質(zhì)含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)；美多巴組損毀側(cè)紋狀體區(qū)GABA.Asp()含量較對照組明顯增加(P＜0.05)；混合組損毀側(cè)狀體區(qū)Glu、Asp及黑質(zhì)網(wǎng)狀部Glu含量較美多巴組減少，但兩者間只有黑

10、質(zhì)網(wǎng)狀部Glu含量存在顯著差異(P＜0.05)。③美多巴組損毀側(cè)紋狀體a-PPT、PDyn、PPEmRNA表達(dá)增強，抗帕Ⅰ號方劑及聯(lián)合美多巴治療可逆轉(zhuǎn)美多巴組損毀側(cè)紋狀體PDynmRNA表達(dá)的增強；并使a-PPTmRNA表達(dá)較對照組增強。 結(jié)論：單獨應(yīng)用抗帕Ⅰ號方劑對多巴胺受體表達(dá)無明顯影響，且抗帕Ⅰ號方劑無明顯受體激動劑的作用。但抗帕Ⅰ號方劑可部分逆轉(zhuǎn)美多巴治療所致基底節(jié)區(qū)氨基酸遞質(zhì)含量的增加及損毀側(cè)紋狀體PDynmRNA表達(dá)

11、的增強，其協(xié)同美多巴治療機(jī)制可能與調(diào)節(jié)直接、間接通路中氨基酸遞質(zhì)含量，調(diào)節(jié)直接、間接通路神經(jīng)肽表達(dá)有關(guān)。 第四部分：抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠氧化應(yīng)激及PC12細(xì)胞凋亡的影響 目的：探討抗帕Ⅰ號方劑對帕金森病大鼠紋狀體氧化應(yīng)激及抗氧化指標(biāo)(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA))的影響；抗帕Ⅰ號方劑對PC12細(xì)胞抗凋亡作用的本質(zhì)及其可能分子機(jī)制。 方法：①6-OHDA損毀制

12、備偏側(cè)帕金森病大鼠模型。PD大鼠分為4組，分別進(jìn)行抗帕Ⅰ號方劑(PDⅠ方劑組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼(美多巴組)、左旋多巴甲酯/芐絲肼/抗帕Ⅰ號方劑(混合組)和生理鹽水(對照組)灌胃治療28天。采用生化法測定PD大鼠損毀側(cè)紋狀體SOD、GSH-Px和MDA的水平。②分別以PBS、L-dopa、PD-Ⅰ高、中、低濃度預(yù)處理PC12細(xì)胞后，以100umol/L左旋多巴甲脂處理24h，用AnnexinV-PI雙染色法行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；

13、RT-PCR法檢測Caspase-3mRNA表達(dá)；Western-blot檢測NF-κBP65蛋白酶原的切割。結(jié)果：①PDⅠ方劑組及美多巴組損毀側(cè)紋狀體SOD、GSH-Px含量較對照組顯著增加(P＜0.05)，MDA含量較對照組降低(P＜0.05)；而單獨應(yīng)用美多巴治療，SOD、GSH-Px、MDA含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)。②流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡百分率，各組分別為：7.7％±2.7％，66.8％±22.0％，11

14、.4％±3.4％，10.6％±3.8％，33.2％±12.6％，L-dopa組、PD-Ⅰ低濃度組較對照組有顯著性差異(P＜0.05)；PD-Ⅰ高、中濃度組較L-dopa組、PD-Ⅰ低濃度組有顯著性差異(P＜0.05)。③L-dopa組、PD-Ⅰ低濃度組Caspase-3mRNA表達(dá)較對照組、PD-Ⅰ高、中濃度組顯著增強(P＜0.05)，L-dopa組與PD-Ⅰ低濃度組Caspase-3mRNA表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。④L-doo