紫杉醇耐受卵巢癌細(xì)胞亞株存在細(xì)胞骨架相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子上調(diào).pdf

1、研究背景卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，由于75％卵巢癌患者在初次診斷時(shí)已為晚期，化療成為與手術(shù)同樣重要的治療手段。雖然卵巢癌患者對(duì)當(dāng)今卡鉑-紫杉醇一線(xiàn)化療方案的初次反應(yīng)率高達(dá)80％，但是50％左右的患者在初次治療抑制后2至3年復(fù)發(fā)，并且再次治療不理想，最終死于藥物耐受。因此藥物耐受已成為臨床治療的主要障礙。 紫杉醇(paclitaxel，taxol)在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞骨架——微管，通過(guò)促進(jìn)微管聚合而干擾有絲分裂期紡

2、錘體功能，并激活紡錘體檢查點(diǎn)使有絲分裂停止，染色體分離失敗。目前對(duì)紫杉醇藥物耐受的研究主要關(guān)注于P-糖蛋白、微管蛋白亞型及微管結(jié)合蛋白表達(dá)的改變以及凋亡信號(hào)途徑異常等方面，但其耐藥機(jī)理仍不明確。 藥物耐受的形成是多步驟多基因共同作用的結(jié)果，可能涉及多個(gè)蛋白表達(dá)及功能的變化，以雙向電泳、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)為核心技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)為腫瘤藥物耐受研究提供了一個(gè)新的高通量技術(shù)平臺(tái)。它以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從細(xì)胞水

3、平動(dòng)態(tài)分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。如今蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用到腫瘤分子生物學(xué)的研究中，而應(yīng)用于藥物耐受相關(guān)研究還處于起始階段，目前應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究卵巢癌紫杉醇耐受的相關(guān)蛋白國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。 研究目的建立卵巢癌細(xì)胞株與其紫杉醇耐藥細(xì)胞亞株的差異蛋白表達(dá)圖譜，尋找與紫杉醇藥物耐受相關(guān)蛋白，并探索其作為臨床藥物耐受預(yù)示和逆轉(zhuǎn)靶

4、的可能性。 方法以人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株(SKOV3)和其紫杉醇穩(wěn)定耐藥細(xì)胞亞株(SKOV3-TR30)為研究對(duì)象。在總蛋白提取后，采用24cm，pH4-7的IPG膠條進(jìn)行第一相等電聚焦，12％SDS-PAGE進(jìn)行第二向電泳分離，凝膠銀染后用PDQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖像分析，建立SKOV3與SKOV3-TR30的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜。差異表達(dá)蛋白采用LCQDecaXP型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用質(zhì)譜分析

5、得到的原始數(shù)據(jù)，搜索IPI上的人非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IPI.HUMAN.v3.07.fasta)從而鑒定蛋白。然后采用蛋白免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白Sorcin、CathepsinB及HSP27進(jìn)行定量和定位檢測(cè)。 結(jié)果經(jīng)過(guò)組內(nèi)與組間三次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)每次實(shí)驗(yàn)均有相似變化的差異點(diǎn)23個(gè)。與親本細(xì)胞相比，在耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)大于3倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)有16個(gè)(P＜0.05)，在耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)大于3

6、倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)有7個(gè)(P＜0.05)。在23個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)中，我們選取圖象清晰、表達(dá)穩(wěn)定、位置固定且相對(duì)居中的蛋白點(diǎn)12個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，其中7個(gè)蛋白點(diǎn)得到初步鑒定。分別為可溶性抗藥性相關(guān)鈣結(jié)合蛋白、組織蛋白酶B前體、調(diào)寧蛋白3、熱休克蛋白27、波形纖維蛋白、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶和血紅蛋白β鏈。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，Sorcin、CathepsinB及HSP27在紫杉醇耐藥細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的親本細(xì)胞(P＜0.05