卵巢癌患者尿液及紫杉醇處理HeLa細(xì)胞的代謝組學(xué)分析.pdf

1、第一部分:尿液代謝物構(gòu)成與卵巢癌臨床分期的相關(guān)性分析
　　卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。其發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，多數(shù)患者發(fā)病時(shí)已處于晚期。卵巢癌的臨床分期可為臨床治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)，對(duì)卵巢癌病情的判斷、治療方案的制定和預(yù)后的估計(jì)至關(guān)重要。
　　代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的一門新興學(xué)科，主要研究生物體系受到刺激或擾動(dòng)后小分子代謝物（分子量小于1000

2、）的變化。其在腫瘤代謝標(biāo)志物的尋找和發(fā)病機(jī)制的闡明等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。由于臨床分期可對(duì)卵巢癌的病情做出明確的界定，因此本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)探查尿液代謝物構(gòu)成與卵巢癌臨床分期的相關(guān)性，以期為尋找簡(jiǎn)便的用于篩查卵巢癌患者和判斷卵巢癌病情的方法提供線索。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.收集15例正常人和56例原發(fā)性上皮性卵巢癌患者的晨尿，用甲醇提取尿液中的代謝物并用0.45μm濾膜過(guò)濾后低溫冰箱保存。
　　2.采

3、用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)提取的代謝物進(jìn)行檢測(cè)，并提取三維數(shù)據(jù)。
　　3.用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。
　　4.對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的相應(yīng)分析結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)，確定尿液中主要的差異代謝物。通過(guò)單因素方差分析(one-wayANOVA)和最小顯著差(LSD)t檢驗(yàn)對(duì)代謝物進(jìn)行分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　尿液樣品經(jīng)HPLC-MS檢測(cè)后用P

4、CA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示健康人和不同臨床分期卵巢癌患者的樣品點(diǎn)在得分圖中存在分離趨勢(shì)。用PLS-DA作進(jìn)一步分析，分類結(jié)果較PCA得到明顯改善。通過(guò)對(duì)結(jié)合VIP值和相關(guān)系數(shù)得到的差異點(diǎn)進(jìn)行非配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)，及對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)，能夠體現(xiàn)健康人與不同臨床階段卵巢癌患者之間代謝差別的尿中代謝物被篩選出來(lái)，它們是N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸、5'-甲硫腺苷、尿酸-3-核苷、假尿嘧啶核苷、L-纈氨酸、琥珀酸、L-脯氨酸及β-

5、煙酰胺單核苷酸。這些化合物在正常人和處于不同臨床階段的卵巢癌患者尿液中含量存在明顯差異(P＜0.05或0.01)，且隨著卵巢癌患者病情的發(fā)展呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　不同臨床分期卵巢癌患者尿液代謝物構(gòu)成存在差異，卵巢癌患者尿液代謝物構(gòu)成與臨床分期有相關(guān)性。
　　第二部分:紫杉醇對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞代謝影響的研究
　　宮頸癌是婦科腫瘤所致死亡的第二位常見(jiàn)原因，嚴(yán)重影響女性的健康。宮頸癌常用治療方法有手術(shù)、放

6、療、化療以及靶向治療和免疫療法等，其中化療藥物在宮頸癌治療中占重要地位。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紫衫樹中提取的一種化合物，為最常用的抗腫瘤藥物之一。PTX是宮頸癌化療的首選藥物之一，對(duì)宮頸癌有確切的療效。
　　PTX可結(jié)合微管蛋白，增強(qiáng)微管蛋白的穩(wěn)定性，阻礙細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，PTX對(duì)免疫系統(tǒng)亦有調(diào)節(jié)作用，多項(xiàng)研究提示PTX可以影響癌細(xì)胞的代謝。
　　代謝組學(xué)是研究生命體系受到刺激或者基

7、因改變時(shí)，代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)，旨在對(duì)有機(jī)體或生物流體內(nèi)所有的代謝產(chǎn)物進(jìn)行綜合的定量和定性分析。本研究使用代謝組學(xué)技術(shù)，觀察PTX對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞代謝的影響，從細(xì)胞代謝水平探查PTX抗宮頸癌的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.用MTT試驗(yàn)分析PTX對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。根據(jù)PTX對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響，確定代謝組學(xué)研究的合適的藥物濃度及作用時(shí)間。
　　2.用PTX處理HeLa細(xì)胞，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞內(nèi)的

8、代謝物。用快速高分辨液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)代謝物進(jìn)行分析。
　　3.結(jié)合主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis，PLS-DA)尋找差異代謝物。差異代謝物的統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.通過(guò)安捷倫MET

9、LIN個(gè)人化合物數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)(PCDL)及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物進(jìn)行檢索比對(duì)，確定差異代謝物及相關(guān)代謝途徑和關(guān)鍵酶。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.PTX對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間和濃度效應(yīng)關(guān)系。隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PTX對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。藥物濃度為100nmol/L、處理時(shí)間為48h時(shí)，HeLa細(xì)胞的存活率為65％，選定該藥物濃度及處理時(shí)間為細(xì)胞代謝組學(xué)研究處理?xiàng)l件。

10、>　　2.PTX對(duì)HeLa細(xì)胞的代謝有廣泛的影響。PTX可使HeLa細(xì)胞內(nèi)殼多糖、N1-乙酰精胺、NADH、L-酪氨酸、由谷氨酰胺和兩個(gè)半胱氨酸構(gòu)成的三肽及由甘氨酸和賴氨酸構(gòu)成的二肽的含量降低。同時(shí)，PTX亦可使HeLa細(xì)胞內(nèi)鳥嘌呤核苷、鳥氨酸、尿素、乳酸、絲氨酸、脯氨酸以及由脯氨酸、賴氨酸、甘氨酸構(gòu)成的三肽和由脯氨酸、賴氨酸、丙氨酸構(gòu)成的三肽增多。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　PTX對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的多種氨基酸代謝、核苷酸代謝、