腫瘤抑制基因的DNA甲基化在肝移植后肝癌復發(fā)預測中的價值研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤，占全世界腫瘤發(fā)生率的第五位。我國作為乙肝大國，國民中乙型肝炎病毒攜帶率高，作為肝炎-肝硬化-肝癌這一進展鏈的終末端，肝癌的高發(fā)成為不爭的事實，從而使我國成為全世界肝癌的最高發(fā)地區(qū)之一。不可否認的是，經過幾十年的不斷努力，我國在肝癌的診治上取得了舉世矚目的成就。但是以手術切除為基礎的各種綜合治療（包括放射、化學、生物、靶向、肝移植等治療手段）依然

2、無法解決HCC總體預后不佳這一難題。隨著肝臟外科水平的進步和肝癌受者入選標準的進一步規(guī)范，肝臟移植被認為是治療肝癌的一種理想治療手段，但是肝臟移植術后腫瘤的轉移復發(fā)這個瓶頸問題依然嚴重制約肝癌的治療效果。近年來，圍繞肝移植后肝癌復發(fā)轉移這一核心問題，有關預測肝癌復發(fā)的生物學標記的研究不斷升溫，成為重要的研究方向。
　　 隨著對腫瘤轉移認識的不斷深入和人類基因組學的長足發(fā)展，人們已經意識到肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及到多基因改變、調控

3、的復雜過程，基于惡性腫瘤基因改變、調控的相關研究成為熱點。而作為新興的表觀遺傳學最重要的研究內容，DNA甲基化所致抑癌基因轉錄失活，進而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展這一問題也成為研究者關注的焦點。然而，通過文獻回顧發(fā)現(xiàn)，目前有關新腫瘤抑制基因PCDH10以及基于多個腫瘤抑制基因同時甲基化的分子表型——CpG島甲基化表型(CpG islands methylator phenotype CIMP)在肝移植后肝癌復發(fā)預測中的價值國內外尚無報道，因此我

4、們此前研究的基礎上，首次嘗試建立一個能反映肝癌生物學特征的CpG島甲基化表型，探討其在肝移植后肝癌復發(fā)預測中的價值；并以新型TSG-PCDH10作為研究對象，系統(tǒng)研究作為優(yōu)化的CIMP的候選TSG在肝細胞肝癌進展中的作用及其調控機制，以期建立一個與復發(fā)密切相關的CIMP模型，為進一步提高肝癌肝移植的早期復發(fā)預測能力，建立肝癌肝移植“中國標準”提供候選的新的腫瘤生物學參數(shù)。
　　 第一部分：腫瘤抑制基因的DNA甲基化及相關CpG島

5、甲基化表型對肝移植后肝癌復發(fā)預測的價值研究
　　 目的：
　　 基因啟動子區(qū)甲基化是最重要的表觀遺傳修飾，通過結合甲基化結合域(MBD)和組蛋白乙?；芤鸹虻谋磉_沉默，尤其是抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了非常重要的作用。肝癌中多個基因啟動子區(qū)的協(xié)同甲基化所形成的CpG島的甲基化表型被證實與肝癌病理，如甲胎蛋白的升高有密切關系。本實驗通過檢測肝癌中多基因啟動子區(qū)的甲基化，觀察腫瘤相關基因甲基

6、化在肝癌中的發(fā)生情況，建立與肝移植肝癌復發(fā)預后相關CpG島甲基化表型，并分析CpG島甲基化表型與臨床病理指標之間的聯(lián)系。
　　 方法：
　　 選取P16, CDH1, GSTP1, DAPK, MGMT, XAF1, TIMP3, SOCS1, SFRP1, TMS1, SYK, DKK1共12個腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域CpG島上甲基化位點（上述基因已知可能與人類不同惡性腫瘤，特別是消化道腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移乃至預后相關

7、），應用甲基化特異性PCR(MethylaTiO2-Specific PCR)首先對小規(guī)模20例HCC肝移植病人的病肝組織DNA進行甲基化狀況的初篩，將其中甲基化頻率高于40％的7個腫瘤抑制基因(P16, CDH1, GSTP1, DAPK, XAF1, SOCS1, SYK)作為CpG島甲基化表型的標志基因，并將上述位點的甲基化檢測擴大到65例HCC肝移植病人的病肝組織DNA樣本，然后根據(jù)甲基化狀況的不同對65例病人進行CpG島的甲基

8、化表型(CIMP)分類；另一方面對肝癌肝移植病人進行臨床病理資料的收集，對病人進行隨訪，比較不同CpG島甲基化表型與病人臨床病理指標及移植術后的3年無復發(fā)生存之間的關系。
　　 結果：
　　 所檢測的臨床樣本中12個基因的甲基化頻率各不相同：從MGMT的5％到XAF1的66％不等；所選擇的7個CpG島甲基化表型的標志基因中，存在協(xié)同甲基化現(xiàn)象，即P16與SYK同時甲基化(P=0.001)，P16與CDH1同時甲基化(P=

9、0.008)，CDH1與DAPK同時甲基化(P=0.003)。在分析了單個腫瘤抑制基因與臨床病理學指標及預后信息后發(fā)現(xiàn)：GSTP1的高甲基化與低組織學分級(P=0.003)和多發(fā)的腫瘤個數(shù)有關(P=0.011)；XAF1的高甲基化與病人術前AFP水平存在相關性(P=0.007)，此外DAPK的甲基化狀況與腫瘤的大小也存在一定的聯(lián)系(P=0.016)，但其他單個基因的甲基化狀況與病人的臨床病理學指標均無統(tǒng)計學差異，并且所有單個基因的甲基化

10、狀況與病人的復發(fā)預后也無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。應用Log-rank檢驗，分析甲基化數(shù)目與復發(fā)生存的關系，發(fā)現(xiàn)在所選擇的7個抑癌基因中，大于等于3個基因發(fā)生甲基化與肝移植后肝癌復發(fā)具有最顯著的相關性(P=0.004)，因而將CpG島的甲基化表型(CIMP)分類為CIMP陽性（甲基化數(shù)目大于等于3個）和CIMP陰性（甲基化數(shù)目小于3個）。隨后的分析發(fā)現(xiàn)，CpG島的甲基化表型狀態(tài)與術前AFP水平和腫瘤大小存在相關性(P值分別為0.0

11、17和0.007)，但與病人的其它臨床病理學指標如性別、年齡、是否合并門靜脈癌栓(PVTT)、組織學分級、腫瘤大小均無關(P＞0.05)。同時，結合我們中心之前提出的肝移植杭州標準，證實超越杭州標準的病人比符合杭州標準的病人具有更高的CIMP陽性發(fā)生率(84％ vs.57％，P=0.017)。之后我們運用Kaplan-Meier生存曲線分析CpG島的甲基化表型與肝癌肝移植病人生存期關系時發(fā)現(xiàn)CpG島的甲基化表型陽性組(CIMP+)的病人

12、的移植后三年無復發(fā)生存期比CpG島的甲基化表型陰性組(CIMP-)病人要短，且具有顯著性差異(15.3月vs.30.3月，P=0.004)。Cox單因素分析結果顯示：除了術前AFP水平、腫瘤大小以外，CpG島的甲基化表型狀態(tài)也與復發(fā)顯著相關。多因素分析結果表明：除腫瘤大小外，CpG島的甲基化表型狀態(tài)（危險系數(shù)：3.581；95％可信區(qū)間：(1.473-8.710); P=0.005）也是影響復發(fā)的一個獨立的危險因素。
　　 結論

13、：
　　 CpG島的甲基化表型是影響移植后肝癌復發(fā)的獨立危險因素，對移植后肝癌復發(fā)的預測具有潛在的重要價值。
　　 第二部分：新腫瘤抑制基因PCDH10在肝細胞肝癌中的實驗研究
　　 目的：
　　 原鈣粘蛋白10(PCDH10)，是新近發(fā)現(xiàn)的鈣粘蛋白超家族的一名成員蛋白。早期關于PCDH10的研究主要集中在神經生理方面，認為PCDH10蛋白在大腦發(fā)育，特別是紋狀體軸突延伸和丘腦皮質投射的形成中發(fā)揮了重要作

14、用。最近有研究表明，在鼻咽癌，白血病，宮頸癌，乳腺癌和胃癌等多種腫瘤細胞株和組織中存在由于PCDH10基因啟動子的異常甲基化而導致表達缺失現(xiàn)象，而通過外源性的過度表達PCDH10蛋白能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖，侵襲和轉移，并誘導腫瘤細胞的凋亡。在宮頸癌的研究中則認為PCDH10的甲基化可以作為宮頸癌特異性診斷的一個潛在的標志物。而在胃癌的最新臨床研究中不僅證實PCDH10是一個典型的腫瘤抑制基因，而且PCDH10的高甲基化和病人不良預后

15、有著密切的聯(lián)系。但PCDH10在肝癌中的臨床和基礎研究目前尚未報道，PCDH10蛋白在肝癌細胞中的生物學功能也還不得而知。
　　 方法：
　　 采用Western blotting和免疫組化的方法檢測PCDH10在HCC患者腫瘤組織，癌旁以及正常肝臟組織中蛋白表達情況。用RT-PCR方法檢測去甲基化藥物(5’-Aza-dC)用藥前后肝癌細胞株中PCDH10的mRNA表達水平，研究其表觀遺傳的調控機制，同時采用甲基化特異性

16、PCR(MSP)和重亞硫酸鹽修飾測序PCR(BSP)的方法驗證目的基因的甲基化變化情況，并分析65例肝癌肝移植患者的PCDH10的甲基化狀況與臨床病理指標及復發(fā)預后的相關性；應用RNA干擾和質粒轉染技術，分別模擬PCDH10缺失和過表達兩種情況，進而從正反兩方面來研究PCDH10蛋白對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲和克隆形成能力的影響。
　　 結果：
　　 在我們所選的5種不同肝癌細胞株中，80％肝癌細胞株存在PCDH10mR

17、NA表達水平的降低或缺失，而PCDH10基因的啟動子區(qū)域的高甲基化則是引起基因表達缺失的主要原因。臨床組織標本中則發(fā)現(xiàn)DNA甲基化導致的PCDH10蛋白表達缺失具有腫瘤特異性，即肝癌組織中的表達相對于癌旁組織和正常組織普遍降低，并且發(fā)現(xiàn)PCDH10基因高甲基化的肝癌肝移植病人更容易發(fā)生術后的腫瘤復發(fā)，且預后不良。體外實驗則發(fā)現(xiàn)，PCDH10的過度表達能夠抑制肝癌細胞株的增殖，降低細胞的侵襲和克隆形成能力，并誘導凋亡。
　　 結論