OrexinA及其受體1干預(yù)鼠脂肪細(xì)胞PPAR-γ2及GLUT4mRNA表達(dá)和TG合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、增食欲素(Orexin)是1998年發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)肽，包括orexinA和B。Orexin有二種受體亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，Orexin1受體(OX1R)、Orexin2受體(OX2R)。其中OX1R是首先被發(fā)現(xiàn)的，且與orexin A有較高的親和性。大量的資料顯示，orexinA及其受體參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括攝食、能量平衡、睡眠/覺(jué)醒、呼吸、學(xué)習(xí)與記憶、食物與藥物成癮、應(yīng)激、胃腸道功能等。最近的研究表明，肥胖患者血中Orex

2、in A明顯低于正常人，并且與年齡、BMI呈負(fù)相關(guān);還有研究顯示orexin過(guò)表達(dá)或應(yīng)用藥理學(xué)誘導(dǎo)orexin受體表達(dá)可以阻止高脂飲食大鼠肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展，這些研究提示orexinA與肥胖及胰島素抵抗密切相關(guān)。
　　肥胖是2型糖尿病主要的危險(xiǎn)因素。脂肪組織不僅是體內(nèi)主要的能量?jī)?chǔ)存器官，而且是重要的內(nèi)分泌器官;不僅對(duì)機(jī)體的能量代謝平衡至關(guān)重要，還與胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生有密切關(guān)系。已有研究證實(shí)3T3-L1細(xì)胞（前脂肪細(xì)胞

3、）和脂肪細(xì)胞均存在orexin受體。并且有研究表明Orexin A可以提高脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取率及阻止甘油的釋放;orexinA能夠激活人腎上腺細(xì)胞ERK1/2，JNK和p38 MAPK信號(hào)途徑。研究orexinA對(duì)脂肪細(xì)胞糖脂代謝功能的影響，對(duì)于研究肥胖和胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的過(guò)程具有重要的意義。本課題擬通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)建立肥胖與胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)大鼠模型，檢測(cè)大鼠脂肪組織中OX1R的表達(dá)，以及o

4、rexinA對(duì)脂肪細(xì)胞PPAR-γ2表達(dá)的影響，并誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為分化的脂肪細(xì)胞后，研究orexinA對(duì)分化的脂肪細(xì)胞的GLUT4表達(dá)和脂質(zhì)合成功能的影響及可能的分子機(jī)制，旨在探討orexinA在肥胖及IR中的相關(guān)作用及生物學(xué)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)胰島素抵抗大鼠表達(dá)中的研究
　　選擇4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組(NC組)

5、、高脂飲食組(HF組)。NC組予以普通顆粒飼料、HF組予以高脂飼料，飼養(yǎng)8周。8周后，各組大鼠稱取體重，每組隨機(jī)選取5只進(jìn)行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胰島素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心臟取血，分別進(jìn)行血糖、血脂、胰島素、orexin A水平測(cè)定。處死大鼠后，摘取網(wǎng)膜及附睪周圍脂肪組織稱重，留取脂肪組織，應(yīng)用western blot檢測(cè)脂肪組織OX1R蛋白表達(dá)。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、。
　　二、Orexin A及OX1R對(duì)脂肪細(xì)胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表達(dá)和TG含量的影響
　　體外培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，分別加入不同濃度的orexin A和/或OX1R特異性抑制劑(SB334867)進(jìn)行干預(yù)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPAR-γ2 mRNA表達(dá);分化3T3-L1細(xì)胞9天后，分別予以O(shè)rexin A10-7M、10-8M、10-9M以及OX1R抑制劑孵化細(xì)胞，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPAR-γ2mR

7、NA和GLUT4 mRNA表達(dá)，甘油三酯試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。
　　三、Orexin A及OX1R調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、p38信號(hào)通路蛋白的研究
　　體外誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞，分別加入10-7M濃度的Orexin A和/或ERK、JNK、p38抑制劑及OX1R特異性抑制劑進(jìn)行干預(yù)，western-blot檢測(cè)ERK、JNK、p38總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)GLUT4 mRNA表達(dá)，甘油三酯試劑盒

8、測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)胰島素抵抗大鼠中的表達(dá)
　　1、鉗夾技術(shù)及評(píng)價(jià)指標(biāo)
　　實(shí)驗(yàn)中高脂組大鼠體重、空腹血糖(FBG）、血胰島素(FIns)高于對(duì)照組;高脂組大鼠平均GIR60-120明顯低于對(duì)照組;而高脂組大鼠平均BG60-120高于對(duì)照組。
　　2、肥胖胰島素抵抗大鼠血清生化指標(biāo)及血清胰島素的變化
　　高脂組大鼠血糖、血

9、胰島素、血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平均高于對(duì)照組。
　　3、肥胖胰島素抵抗大鼠血orexin A及脂肪組織OX1R的變化
　　高脂組大鼠血Orexin A水平及脂肪組織的OX1R表達(dá)均低于對(duì)照組，并且OX1R水平與體脂含量、Lee's指數(shù)、TG、TC、血胰島素水平成負(fù)相關(guān)。
　　二、Orexin A及OX1R對(duì)脂肪細(xì)胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表達(dá)和TG含量的影響
　　1、Orexin A對(duì)

10、3T3-L1細(xì)胞PPAR-γ2 mRNA表達(dá)的影響
　　不同濃度的Orexin A均可誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞PPAR-γ2mRNA的表達(dá)，其中10-7M和10-8M組效應(yīng)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且PPAR-γ2mRNA表達(dá)受OX1R抑制劑抑制。
　　2、OrexinA對(duì)分化的脂肪細(xì)胞PPAR-γ2mRNA表達(dá)的影響
　　不同濃度的OrexinA均可誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞PPAR-γ2mRNA的表達(dá)，其中10-7M和10-8M組效應(yīng)具

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且PPAR-γ2mRNA表達(dá)受OX1R抑制劑抑制。
　　3、Orexin A對(duì)分化的脂肪細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)及TG含量的影響
　　不同濃度的OrexinA可上調(diào)分化的脂肪細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)及增加TG含量，其中10-7 M濃度時(shí)的orexinA刺激效應(yīng)最顯著;加入OX1R特異性抑制劑后，orexinA對(duì)分化的脂肪細(xì)胞GLUT4mRNA的表達(dá)及TG合成受到抑制。
　　三、Orexin A及OX

12、1R調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK、p38信號(hào)通路蛋白的研究
　　1、Orexin A通過(guò)MAPK信號(hào)途徑(ERK1/2、JNK、P38)對(duì)分化的脂肪細(xì)胞GLUT4表達(dá)的影響
　　在培養(yǎng)液中加入JNK抑制劑、p38抑制劑分別可抑制10-7M濃度OrexinA誘導(dǎo)的JNK、p38磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表達(dá)，當(dāng)再加入OX1R抑制劑時(shí)這種抑制作用增強(qiáng)。加入ERK抑制劑(U0126)或/和OX1R抑制劑后，Orexin

13、A誘導(dǎo)的ERK磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯的抑制，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、Orexin A通過(guò)MAPK信號(hào)途徑(ERK1/2、JNK、P38)對(duì)分化的脂肪細(xì)胞TG合成的影響
　　在培養(yǎng)液中加入ERK抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑或/和OX1R抑制劑分別可抑制10-7M濃度Orexin A誘導(dǎo)的ERK、JNK、p38磷酸化蛋白水平及TG含量。
　　結(jié)論：
　　1、高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠8周后

14、，可建立肥胖相關(guān)胰島素抵抗大鼠動(dòng)物模型;肥胖相關(guān)胰島素抵抗大鼠血OrexinA水平降低;脂肪組織OX1R蛋白表達(dá)水平降低，表明orexinA及OX1R可能參與脂肪組織功能的調(diào)節(jié)。
　　2、Orexin A通過(guò)OX1R介導(dǎo)可上調(diào)3T3-L1細(xì)胞PPAR2 mRNA水平，并上調(diào)分化的3T3-L1細(xì)胞PPARγ2 mRNA水平，提示Orexin A可能在前脂肪細(xì)胞的分化中發(fā)揮一定作用。
　　3、OrexinA通過(guò)OX1R介導(dǎo)激活M