ERK表達(dá)及活化在食管癌進(jìn)展過(guò)程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,1999年WHO資料中顯示,中國(guó)食管癌患者占世界總數(shù)的46.6％,90％的食管癌為鱗癌,腺癌約占5％～10％。每年因食管癌而死亡的人數(shù)已列居惡性腫瘤的第四位。盡管目前食管癌的癌前病變病理論斷技術(shù)已有很大的提高,新的預(yù)防措施和更有效的聯(lián)合治療方法的改進(jìn),仍阻擋不了食管癌發(fā)病率的上升。因此,進(jìn)一步研究臨床抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)及食管癌變過(guò)程中相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化,仍為食管癌的治療研究的目標(biāo)。
　　 細(xì)

2、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERKs)為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一個(gè)亞族,廣泛存在于各種生物體中,在細(xì)胞癌變過(guò)程中具有重要作用。其可被多種絲裂原信號(hào)和癌基因產(chǎn)物激活成磷酸化狀態(tài)(P-ERK),轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞核內(nèi),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理過(guò)程,并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。
　　 羥基喜樹堿(HCPT)是近年從我國(guó)珙桐科植物喜樹中提取的

3、抗癌生物堿——喜樹堿的衍生物,是我國(guó)臨床一線的化療藥物,廣泛用于胃腸道惡性腫瘤、肝癌、白血病、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤的化療。但其抗癌作用機(jī)制目前尚不十分清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),羥基喜樹堿能阻止腫瘤細(xì)胞從S期進(jìn)人G2/M期,并可誘發(fā)其細(xì)胞凋亡。
　　 本課題通過(guò)研究ERK表達(dá)及其活化(P-ERK)與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)臨床病理特征關(guān)系,HCPT對(duì)食管癌細(xì)胞株Eca109和P-ERK的相關(guān)性影響,探討ERK在食管癌發(fā)生發(fā)展中的意義

4、,為食管癌的綜合性防治研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 ERK在食管癌組織中的表達(dá)及其意義
　　 目的:研究食管鱗狀細(xì)胞癌組織及黏膜組織中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的表達(dá)及磷酸化水平,探討ERK在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用及其意義。
　　 方法:收集60例新鮮食管癌組織和25例粘膜組織,食管癌組織經(jīng)臨床病理確診為鱗狀細(xì)胞癌。采用RT-PCR法及Western blot法分別檢測(cè)食管癌組織與粘膜組織ERK轉(zhuǎn)錄水

5、平和翻譯水平的表達(dá)情況及ERK活性水平的高低,并與食管癌臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性討論分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR結(jié)果顯示:食管癌組織中ERK基因的條帶密度和寬度明顯高于粘膜組織?？梢奅RK mRNA基因表達(dá)在食管癌組織中明顯增高,而在粘膜組織中呈現(xiàn)低表達(dá)。食管癌組織ERK mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(0.656±0.070),粘膜組織為(0.450±0.055)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　

6、 2.由Western blotting結(jié)果可以看出,ERK及其活化狀態(tài)(P-ERK)在食管癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng),而在食管粘膜組織中則呈低表達(dá)。食管粘膜組織及癌組織中ERK及P-ERK的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.581±0.053 vs0.702±0.703；0.542±0.053 vs0.659±0.072)。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.ERK的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:ER

7、K在患者的年齡(≥60與<60)、性別(男與女)和分化程度(高中分化與低分化)各組間的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05),而在臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組間有顯著性差異(P<0.05),且T3-4期患者ERKmRNA基因的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于T1-2期患者(0.717±0.049 vs0.643±0.067,P<0.01);食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ERK mRNA基因的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(0.705±0.071 vs0.645±0.066

8、,P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示:T3-4期與T1-2期患者P-ERK及ERK的表達(dá)強(qiáng)度(0.700±0.068 vs0.648±0.069,P<0.05；0.743±0.056 vs0.691±0.070,P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者P-ERK及ERK的表達(dá)強(qiáng)度與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(0.695±0.054 vs0.648±0.072,P<0.05;0.736±0.072 vs0.690±0.066,P<0.0

9、5)。與RT-PCR顯示的結(jié)果相一致。
　　 小結(jié):
　　 1.ERK及其磷酸化水平在ESCC組織中升高,提示ERK及其活化在ESCC發(fā)生中起著不可或缺的作用；
　　 2.ERK的表達(dá)及其磷酸化水平與ESCC臨床分期、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性,表明ERK的表達(dá)及其磷酸化在ESCC發(fā)展中起著重要作用；
　　 3.尚可認(rèn)為進(jìn)一步研究抑制ERK通路的抗腫瘤藥物,作為藥物治療ESCC的新靶點(diǎn)。
　　

10、第二部分食管鱗癌中ERK活化作用機(jī)制的研究
　　 目的:通過(guò)培養(yǎng)人食管癌Eca109細(xì)胞株,觀察羥基喜樹堿(HCPT)對(duì)P-ERK活性和食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響,進(jìn)一步闡明ERK促進(jìn)食管癌發(fā)展的作用機(jī)制,為臨床治療提供合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:培養(yǎng)人食管癌Eca109細(xì)胞株,加入含有不同濃度的HCPT(50μm/l,10μm/l,20μm/l),采用MTT法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株增殖情況,采用流式細(xì)胞術(shù)分析食管細(xì)胞株凋亡

11、情況,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)P-ERK蛋白在人食管癌細(xì)胞中的定位及表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示:HCPT對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞株有明顯的抑制生長(zhǎng)的作用。不同濃度HCPT處理的Eca109細(xì)胞株,OD值均有不同程度減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且各組細(xì)胞增殖程度隨HCPT濃度的增高而降低(0.989±0.047；0.860±0.095；0.748±0.036；0.541±0.045),當(dāng)藥物濃

12、度達(dá)到20μm/l時(shí)抑制細(xì)胞增殖達(dá)高峰。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:食管癌Eca109細(xì)胞經(jīng)羥基喜樹堿處理48小時(shí)后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制,且隨HCPT濃度的增加,凋亡率逐漸升高(0.80％；3.52％；3.91％；12.72％；P<0.01)。結(jié)果與前一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)相一致,說(shuō)明HCPT促進(jìn)食管癌細(xì)胞株Eca109凋亡,且抑制作用呈明顯的劑量依賴性。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示:HCPT能顯著影響食管癌細(xì)胞中P-ERK的

13、表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞隨著羥基喜樹堿的濃度逐漸增加,其數(shù)量逐漸減少,棕黃色顆粒逐漸變小,密度逐漸減低(80.33％;57.67％；52.33％；47.67％；P<0.01)。
　　 小結(jié):
　　 1.HCPT抑制食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞增殖,一定濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)藥物劑量依賴性；
　　 2.HCPT促進(jìn)食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞凋亡；
　　 3.P-ERK在癌細(xì)胞中的表達(dá)能夠被HCPT能夠有效的抑制。ERK促