糞腸球菌毒力基因ace敲除及其對(duì)細(xì)菌黏附與生物被膜形成的影響.pdf

1、腸球菌是一類球形或卵圓形，呈對(duì)或短鏈存在，廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中，是人和動(dòng)物體胃腸道正常菌群之一。腸球菌對(duì)人和動(dòng)物致病主要通過(guò)黏附，侵襲以及組織損傷實(shí)現(xiàn)。通過(guò)黏附和腸黏膜的上皮細(xì)胞以及胞外基質(zhì)結(jié)合起來(lái)，占位定植，進(jìn)而侵入到機(jī)體內(nèi)部，對(duì)宿主發(fā)揮生物屏障功能，最終引發(fā)組織損傷。而在腸球菌的眾多毒力因子中，腸球菌膠原蛋白黏附素 ace是腸球菌分泌于菌體表面的一種黏附素，在菌體生物膜形成過(guò)程中起重要作用，有良好的黏附活性。
　　本研究

2、通過(guò)對(duì)毒力因子Ace的研究，希望能對(duì)腸球菌的致病機(jī)理以及臨床防治糞腸球菌的感染提供理論依據(jù)。根據(jù)GenBank中發(fā)表的腸球菌毒力因子Ace的基因序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)ace基因的特異性引物，以糞腸球菌的DNA為模板，PCR擴(kuò)增出1358bp的目的片段，經(jīng)膠回收純化后和載體pTG19-T相連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR擴(kuò)增，酶切鑒定，證明成功構(gòu)建出重組載體。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的從河南省各大豬場(chǎng)分離的43株分離菌以及3株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行ace基因

3、PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)菌株中ace基因的攜帶率及其保守性，結(jié)果顯示，共有30株菌株擴(kuò)出ace基因，攜帶率為71.7％，同時(shí)對(duì)這46株菌進(jìn)行同源比對(duì)，同源性達(dá)98.6%～100.0%。說(shuō)明毒力因子Ace在腸球菌中存在較為廣泛，且基因序列高度保守，可針對(duì)此對(duì)腸球菌Ace做進(jìn)一步研究。
　　本研究運(yùn)用同源重組的方法構(gòu)建糞腸球菌膠原蛋白黏附素ace基因缺失突變株。首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增ace基因并引入酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切及PCR驗(yàn)證后回收目的片段

4、。同時(shí)對(duì)自殺質(zhì)粒pK18mobSacB雙酶切和PCR驗(yàn)證，后經(jīng)T4連接酶作用下轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α，構(gòu)建出帶有kan卡那霉素抗性標(biāo)志的Pk18-ace-kan，經(jīng)PCR以及酶切驗(yàn)證后，送往基因測(cè)序公司測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)去離子后電轉(zhuǎn)化入糞腸球菌野生株ATCC29212中，根據(jù)同源重組原理，篩選出突變株，提取出突變株的基因組DNA，用帶有抗性標(biāo)記的kan基因標(biāo)記探針，對(duì)突變株的基因組DNA進(jìn)行Southern blot

5、雜交，來(lái)證實(shí)ace基因是否已經(jīng)成功被敲除。
　　經(jīng)過(guò)多次的克隆轉(zhuǎn)化，PCR擴(kuò)增，Southern blot分析，結(jié)果表明已成功獲得1株ace基因缺失突變株，命名為ATCC29212△Ace::kan，且經(jīng)過(guò)Southern blot雜交，證明ace基因已被成功敲除，插入kan基因，使ace基因不能正常表達(dá)。
　　轉(zhuǎn)化成功后，分別對(duì)野生株和突變株進(jìn)行細(xì)菌黏附和生物被膜試驗(yàn)的比較，分析突變株的生物學(xué)特性，以期研究突變株對(duì)細(xì)菌黏附

6、和生物被膜形成的改變情況。細(xì)菌黏附試驗(yàn)的比較結(jié)果顯示，ace基因缺失菌株對(duì)宿主菌的黏附性明顯減弱，而在生物被膜試驗(yàn)中，ace基因缺失突變株的生物膜形成能力也減弱。
　　綜上所述，對(duì)從河南各大豬場(chǎng)分離的43株菌株以及3株糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增檢測(cè)，得出 ace基因的攜帶率較高。本研究通過(guò)同源重組的方法成功構(gòu)建出 ace基因的突變株ATCC29212△Ace::kan。經(jīng)Southern blot雜交證明突變成功。生物膜試驗(yàn)以及黏附試驗(yàn)