運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究復(fù)方丹參及其有效單體的內(nèi)皮保護(hù)作用機(jī)理.pdf

1、研究背景與目的:該研究建立了以心血管疾病相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)寡核苷酸芯片為技術(shù)核心的研究平臺(tái),并應(yīng)用該芯片研究復(fù)方丹參的有效單體三七皂苷Rg1、丹參素和三七皂苷Re1對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,從而進(jìn)一步探討上述藥物的內(nèi)皮保護(hù)作用的分子機(jī)理.同時(shí)對(duì)丹參素、三七皂苷Re1和復(fù)方丹參對(duì)oxLDL損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的影響基因進(jìn)行聚類分析,為中藥復(fù)方的研究提供一個(gè)有益的探索.材料和方法:(1)第一部分:檢索Cardio數(shù)據(jù)庫(kù),獲得五百余個(gè)心血管疾病

2、相關(guān)基因;從Genebank中獲得這些基因的mRNA序列;運(yùn)用Mprobe設(shè)計(jì)檢測(cè)用寡核苷酸探針;在線BLAST同源分析,獲得特異性最佳的寡核苷酸探針序列;設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和看家基因的探針作為芯片的質(zhì)控點(diǎn);合成探針、點(diǎn)樣制備芯片;提取培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的總RNA;將完全相同的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成Cy3或Cy5標(biāo)記的cDNA熒光探針;芯片雜交,對(duì)芯片進(jìn)行檢測(cè)的靈敏度、特異性、重復(fù)性和真實(shí)性進(jìn)行分析.(2)第二部分:用

3、致炎因子TNF-α刺激HUVEC,檢測(cè)HUVEC釋放NO的量,從而建立內(nèi)皮功能失常的體外模型;篩選三七皂苷Rg1保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的有效作用濃度;運(yùn)用制備的芯片研究三七皂苷Rg1對(duì)TNF-α刺激的內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響;用RT-PCR和Westernblot方法對(duì)芯片篩選出的差異基因中的一個(gè)基因-eNOS進(jìn)行驗(yàn)證.(3)第三部分:用oxLDL作用于HUVEC,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-MDA的含量,從而建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的體外模型;篩選