利用基因芯片技術(shù)分析青蒿素及其衍生物抑癌作用機(jī)理.pdf

1、目的：利用基因芯片技術(shù)檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因在青蒿素及其衍生物(二氫青蒿素和青蒿琥酯)作用于K562細(xì)胞后的表達(dá)情況，旨在從基因水平上探討青蒿素及其衍生物抑制K562細(xì)胞增殖的機(jī)理，尤其是青蒿素及其衍生物抑制K562細(xì)胞周期作用的分子機(jī)制。 方法：查找相關(guān)文獻(xiàn)，確定與本研究密切相關(guān)的細(xì)胞周期基因，在Gene Bank中查找這些基因的mRNA序列，據(jù)此序列用01ig06.0設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，合成好的探針用SpotArray ASP7

2、201基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制芯片。取對數(shù)生成期的K562細(xì)胞，經(jīng)青蒿素、二氫青蒿素和青蒿琥酯(濃度均為1×10<'-6>mol/L、4×10<'-6>mol/L、16×10<'-6>mol/L、64×10<'-6>mol/L和256×10<'-6>mol/LL)處理24小時，倒置光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，用Hoechst33342/PI雙熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化，再用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。TRIzol試劑提取總RNA

3、，并進(jìn)行質(zhì)控。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，同時用Cy3進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記好的cDNA與細(xì)胞周期相關(guān)基因芯片雜交，用Gene Pix 4100A掃描儀檢測雜交結(jié)果，分析基因表達(dá)情況。 結(jié)果：選擇相關(guān)基因34條，每條基因設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸探針。探針長度約40bp，GC含量40％-60％，自身無二級結(jié)構(gòu)，并與其它基因同源性小于70％。合成的寡核苷酸探針，用SpotArray ASP7201基因芯片點(diǎn)樣儀把探針點(diǎn)在片基上，完成細(xì)胞周期相關(guān)

4、基因芯片構(gòu)建。K562細(xì)胞經(jīng)青蒿素、二氫青蒿素和青蒿琥酯處理24小時后，倒置光顯微鏡下可見：細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮，核分裂相減少，細(xì)胞密度下降，漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)可見多個折光性較強(qiáng)的圓形小泡樣結(jié)構(gòu)和細(xì)胞出芽樣改變。其中，濃度為256×10<'-6>mol/L的青蒿素與64×10<'-6>mol/L、256×10<'-6>mol/L二氫青蒿素和青蒿琥酯處理的細(xì)胞形態(tài)變化較明顯。用Hoechst33342/PI雙

5、熒光染色后，熒光顯微鏡下可觀察到染色質(zhì)高度濃縮、邊緣化，凝聚成明亮的團(tuán)塊，即凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測顯示：處在G<,2>期細(xì)胞的比例明顯增加，被處理的腫瘤細(xì)胞多被阻抑在G2期。TRIzol試劑提取總RNA，總含量均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，純度較高，基本上沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染。電泳分析總RNA的完整性，電泳圖上可見清楚的28S和18S條帶，且28S：18S大約為2:1，表明提取的總RNA質(zhì)量較好，沒有發(fā)生降解?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA與基因

6、芯片在42℃，雜交16小時后，用GenePiX 4100A掃描儀分析雜交結(jié)果。其中17條基因表達(dá)有差異。青蒿素組與正常對照相比表達(dá)下調(diào)的基因有：CyclinDl、Cdl(4、Cdk2、Cdc2、DNA-PK、DNA-TopoI、MCL-1、ERK-3、JNK、VEGF，共計(jì)10個；二氫青蒿素組與正常對照相比表達(dá)上調(diào)的基因有：Chk1，表達(dá)下調(diào)的基因有：PCNA、CyclinBl、CyclihDl、CyclinEl、Cdk4、Cdk2、E

7、2F1、DNA-PK、DNA-T0poI、MCL-1、JNK、VEGF，共計(jì)13個；青蒿琥酯組與正常對照相比表達(dá)上調(diào)的基因有：p21、Chkl，表達(dá)下調(diào)的基因有：CyclinBl、CyclinEl、E2F1、DNA-PK、hTERT、Bcl-2、VEGF、JNK，共計(jì)10個。 結(jié)論：青蒿素及其衍生物(二氫青蒿素和青蒿琥酯)可以抑制K562細(xì)胞增殖。作用機(jī)制主要是通過改變細(xì)胞周期某些調(diào)控物質(zhì)的基因表達(dá)來阻抑K562的細(xì)胞周期運(yùn)行；