兩種青蒿素衍生物毒理學(xué)再評(píng)價(jià)及其心臟毒性機(jī)制研究.pdf

1、目的和意義:青蒿素及其衍生物是臨床上治療瘧疾的一線藥物，目前已經(jīng)用于治療多種原蟲感染，動(dòng)物和細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)青蒿素類衍生物還具有抗腫瘤、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。為了擴(kuò)大青蒿素類藥物的臨床適應(yīng)癥，迫切需要開展臨床前試驗(yàn)研究，以支持臨床用藥。本課題研究目的是觀察青蒿素衍生物在低劑量長期給藥時(shí)的毒性反應(yīng)和靶器官，以及心臟毒性作用機(jī)制，為臨床安全合理用藥提供支持。
　　材料與方法:試驗(yàn)采用Beagle犬64只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、青蒿琥酯口

2、服給藥組(6 mg/kg)、肌肉注射溶劑對(duì)照組和蒿甲醚肌肉注射組（6 mg/kg）。每組16只動(dòng)物，雌雄各半。每周給藥6次，連續(xù)給藥13周，分別在給藥第4周、第8周和給藥結(jié)束每組分別剖殺雌、雄各2只動(dòng)物。剩余動(dòng)物繼續(xù)觀察2、4周后剖殺。檢查項(xiàng)目包括:一般臨床指標(biāo)觀察（包括體重、攝食量、體溫、心電圖及神經(jīng)行為學(xué)），眼科檢查，血液學(xué)和血生化指標(biāo)檢測，骨髓涂片檢查，尿液檢查，組織病理學(xué)檢查（包括全部臟器，神經(jīng)系統(tǒng)和心臟傳導(dǎo)系組織作為重點(diǎn)觀察）

3、，超微病理學(xué)檢查（肝臟、心臟和腎臟）和伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究。采用膜片鉗技術(shù)觀察青蒿素對(duì)CHODUO細(xì)胞hERG通道的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)一般臨床觀察指標(biāo):動(dòng)物體重、攝食量、眼科檢查和尿液檢查均未見異常，未見神經(jīng)行為學(xué)癥狀（震顫、麻痹、嘔吐、共濟(jì)失調(diào)、聽力和視覺障礙等）出現(xiàn)。
　　(2)注射部位改變:肌肉注射蒿甲醚后，從實(shí)驗(yàn)第4天起部分動(dòng)物雙后肢注射部位發(fā)紅、變硬、輕度腫脹。之后持續(xù)加重，2周后全部動(dòng)物雙后肢注射

4、部位均呈發(fā)紅、發(fā)硬、腫脹等表現(xiàn)。蒿甲醚組癥狀明顯重于溶劑對(duì)照組。恢復(fù)4周后注射部位上述表現(xiàn)明顯減輕。
　　(3)心電圖檢查發(fā)現(xiàn):在W-1，W1，W3，W5，W7，W9，W11，W13，W15和W17測定心電圖，記錄HR、PR、QRS和QT相關(guān)測量數(shù)據(jù)，根據(jù)QT500=QT-0.084×(RR-500)公式對(duì)QT進(jìn)行校正（由于PQ和QT間期隨心率快慢而變化，根據(jù)心率為120次/分鐘RR間期為500毫秒進(jìn)行矯正），蒿甲醚肌肉注射組與溶

5、劑對(duì)照組相比QT間期明顯延長(P＜0.05);而青蒿琥酯口服組與空白對(duì)照組相比心率明顯降低(P＜0.05)。
　　(4)血液學(xué)檢查發(fā)現(xiàn):肌肉注射溶劑對(duì)照組和蒿甲醚肌肉注射組WBC、NE％、MO％指標(biāo)升高，而青蒿琥酯口服組和蒿甲醚肌肉注射組均可見部分動(dòng)物紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降(W2)和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)改變（蒿甲醚肌肉注射組部分動(dòng)物RET％顯著增加，青蒿琥酯口服組部分動(dòng)物RET％顯著下降）。
　　(5)血生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn):蒿甲醚肌肉注射組見A

6、ST、CK升高，Na+下降;而肌肉注射溶劑對(duì)照組和蒿甲醚肌肉注射組均可見A/G比例下降，K+下降。
　　(6)骨髓細(xì)胞涂片鏡檢發(fā)現(xiàn):蒿甲醚肌肉注射組W4時(shí)原始、早幼粒細(xì)胞顯著減少，W8至W12桿狀、分葉粒細(xì)胞顯著減少，W8時(shí)紅系造血細(xì)胞增加，以中晚期紅細(xì)胞為主。青蒿琥酯口服組在W8原始早幼粒細(xì)胞顯著減少。恢復(fù)期上述變化均恢復(fù)正常。
　　(7)病理大體檢查發(fā)現(xiàn):肌肉注射溶劑對(duì)照組和蒿甲醚肌肉注射組均可見注射部位形成硬結(jié)，皮下出

7、血，縱切剖開可見肌間灰白色條索狀組織。
　　(8)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn):W4時(shí)青蒿琥酯口服組和蒿甲醚肌肉注射組部分動(dòng)物骨髓出現(xiàn)抑制，主要表現(xiàn)為紅系受抑，紅細(xì)胞成熟障礙，幼稚紅細(xì)胞增多，成熟紅細(xì)胞減少;之后有加重趨勢，直至給藥結(jié)束。W4時(shí)青蒿琥酯和蒿甲醚組均在脾臟出現(xiàn)髓外造血灶，至W8和W13髓外造血灶呈增多趨勢。W4、W8青蒿琥酯組各見1只動(dòng)物十二指腸上皮壞死脫落，腸隱窩擴(kuò)張。W8蒿甲醚組出現(xiàn)大腦皮層神經(jīng)元變性壞死(2/4)和脊髓灰

8、質(zhì)神經(jīng)元變性壞死(3/4)，至W17時(shí)，仍有1/4只動(dòng)物查見大腦皮層及脊髓神經(jīng)元變性壞死。與對(duì)照組相比，蒿甲醚肌肉注射組注射部位病理損傷明顯加重。
　　(9)心臟傳導(dǎo)系檢查發(fā)現(xiàn):W8時(shí)青蒿琥酯口服組個(gè)別動(dòng)物心臟竇房結(jié)可見慢性炎癥改變，并有少量脂肪浸潤;W13時(shí)可見2/4動(dòng)物房室結(jié)P、T細(xì)胞空泡變性，W17時(shí)未見明顯異常。蒿甲醚肌肉注射組心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)未見明顯異常。
　　(10)超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn):W4時(shí)青蒿琥酯和蒿甲醚組均可見心

9、、肝、腎等臟器細(xì)胞線粒體腫脹、空泡化等改變，W8、W13仍然可見，至恢復(fù)期結(jié)束上述改變尚未完全恢復(fù)。
　　(11)伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究表明:青蒿琥酯和蒿甲醚在體內(nèi)均代謝為二氫青蒿素(DHA)。在D1、D15和D28血中蒿甲醚濃度能夠進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算D1和D5 AUC(0-t)，t1/2z和Tmax的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，蒿甲醚肌肉注射組:蒿甲醚反復(fù)給藥28天，體內(nèi)蒿甲醚吸收加快，消除加快，但暴露量變化不大;而在D58和D93體內(nèi)蒿甲醚和

10、DHA暴露逐漸降低。青蒿琥酯口服組:青蒿琥酯及其代謝產(chǎn)物DHA的暴露量較穩(wěn)定。另外，在相同劑量（6 mg/kg）下，與肌肉注射蒿甲醚相比，青蒿琥酯組體內(nèi)DHA的暴露相對(duì)較高。
　　(12) hERG通道檢測:采用全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)，以表達(dá)hERG鉀通道的CHO細(xì)胞為標(biāo)本，觀察不同濃度的青蒿琥酯和蒿甲醚對(duì)hERG鉀通道的影響。發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯的IC50分別為5.51±5.40 mM(n=3)，認(rèn)為青蒿琥酯對(duì)hERG鉀通道沒有明顯的阻斷作用

11、;而蒿甲醚對(duì)hERG鉀通道具有阻斷作用，其IC50為124.91±55.19μM(n=3)。
　　結(jié)論:(1)青蒿琥酯和蒿甲醚都能引起B(yǎng)eagle犬骨髓抑制和外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、脾臟髓外造血，以上變化最早出現(xiàn)在W2，是出現(xiàn)最早的敏感指標(biāo)。(2)青蒿琥酯和蒿甲醚對(duì)心臟形態(tài)和功能均有影響，但是表現(xiàn)不同:青蒿琥酯能導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)系（竇房結(jié)和房室結(jié)）P細(xì)胞和T細(xì)胞變性和炎癥改變，心電圖顯示心率顯著下降;而蒿甲醚則導(dǎo)致QT間期延長，其作用機(jī)

12、制很可能與hERG通道被抑制有關(guān)。(3)青蒿琥酯和蒿甲醚都可導(dǎo)致心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的腫脹、空泡變等損傷，表明線粒體是其作用的靶點(diǎn)之一。(4)蒿甲醚肌肉注射后可導(dǎo)致注射部位局部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。(5)蒿甲醚組可見大腦皮層和脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元散在輕度變性壞死，受損神經(jīng)元細(xì)胞尼氏體減少或消失，但未見神經(jīng)行為學(xué)改變。(6)反復(fù)肌肉注射蒿甲醚使局部肌肉出現(xiàn)損傷而影響了藥物的吸收，從而導(dǎo)致給藥后期AUC下降和