微生物和水果源的多酚氧化酶固定化合成茶黃素研究.pdf

1、茶黃素是茶葉中一種重要的功能成分，在紅茶中的含量僅為0.2-2.0％，因而從紅茶中直接提取制備茶黃素分離純化的難度大，且得率低；采用化學(xué)氧化法，需要投入更多的廢水處理費(fèi)用，并且由于化學(xué)法缺乏底物專一性，副產(chǎn)品復(fù)雜，產(chǎn)品純度受到一定限制；體外酶促氧化法則是比較合適的方法，但茶鮮葉來源的酶受季節(jié)、茶樹品種等因素限制，且提取方法較難。針對(duì)上述問題，本研究探索了以微生物、水果作為酶源，催化生產(chǎn)茶黃素的技術(shù)條件，并對(duì)得到的酶液進(jìn)行固定化，以期為工

2、業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)茶黃素提供前期工作基礎(chǔ)。結(jié)果表明： 1.研究了茶多酚形成茶黃素，茶紅素的藕聯(lián)反應(yīng)，分析了多酚氧化酶、過氧化物酶催化生成茶黃素的能力。結(jié)果顯示，多酚氧化酶、過氧化物酶與茶多酚，以及過氧化物酶與茶黃素反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)Km值分別為1.00×106，2.26×106和22.54×106，表明多酚氧化酶對(duì)底物茶多酚的親和力要明顯高于過氧化物酶，而過氧化物酶對(duì)茶多酚和茶黃素的親和力差異較小，對(duì)茶黃素的生成起不到積極作用。

3、所以在進(jìn)一步生產(chǎn)茶黃素試驗(yàn)中選擇多酚氧化酶作為酶促反應(yīng)的主要酶。 2.研究了微生物來源的多酚氧化酶催化茶多酚生產(chǎn)茶黃素的效果。選擇產(chǎn)PPO的硬毛栓菌、彩絨革蓋菌，恒溫培養(yǎng)數(shù)日后提取并純化酶液，并以此酶液催化茶多酚生產(chǎn)茶黃素。結(jié)果表明，硬毛栓菌的酶活性普遍高于彩絨革蓋菌，且達(dá)到產(chǎn)酶高峰的時(shí)間要早2～4天；該菌產(chǎn)的酶主要是胞外酶，在提取酶時(shí)不需要進(jìn)行細(xì)胞破碎；反應(yīng)生成茶黃素的最適pH為4.5，但催化生成茶黃素的轉(zhuǎn)化率僅為0.2％，與

4、預(yù)期目標(biāo)相差甚遠(yuǎn)。因而，采用微生物源的多酚氧化酶生產(chǎn)茶黃素的技術(shù)路線不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 3.研究了水果N來源的酶液催化生產(chǎn)茶黃素的效果。不同水果品種，勻漿方法，pH值及反應(yīng)時(shí)間對(duì)茶黃素形成有顯著影響，生產(chǎn)茶黃素的最佳條件為：將品種N1果實(shí)，去核不去皮后勻漿，在pH=4.6的反應(yīng)體系中反應(yīng)2小時(shí)。 4.研究了酶固定化技術(shù)對(duì)酶活、茶黃素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，與茶鮮葉相比，水果N1來源的多酚氧化酶活性是茶鮮葉來源的酶的

5、2倍，固定化后兩者的活性均降為固定化前的1/2。從茶黃素的生成量來看，茶鮮葉來源的酶液催化形成茶黃素的能力強(qiáng)于水果N1來源的酶。從固定化酶的穩(wěn)定性來看，該固定化酶經(jīng)過30次的重復(fù)使用，酶活依然保持原有水平的95.6％.在0.1M檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH=5.6，4℃)中貯存30天后，酶活為原有水平的92.6％，可以認(rèn)為該酶的重復(fù)利用性以及穩(wěn)定性都較好。所以用水果N來源的多酚氧化酶在茶鮮葉缺乏的季節(jié)代替茶鮮葉來源的酶生產(chǎn)茶黃素是可行的。酶