c-erbB2反義寡脫氧核苷酸聯(lián)合靶向納米載體用于放射性核素顯像早期診斷乳腺癌的實驗研究.pdf

1、本課題采用硫代化學修飾和白蛋白納米粒增加反義寡脫氧核苷酸的穩(wěn)定性，避免其在體內(nèi)被核酸酶降解。 方法： 第一部分 c-erbB2 ASODN的放射性核素標記及鑒定人工合成一段針對c-erbB2 mRNA 5’端轉(zhuǎn)錄起始位的反義寡脫氧核苷酸，及相應正義序列、無義序列，采用化學方法連結(jié)次乙基雙半胱氨酸(EC)與寡脫氧核苷酸(ODN)，用Sep-Pak C<,18>反相柱純化EC-ODN。用SnCl<,2>和酒石酸鈉對EC-OD

2、N進行<'99m>Tc標記，Sephadex G25柱層析進行純化，薄層層析測定標記率、比活度、放射化學純度。分別測定<'99m>Tc-EC-ODN 在室溫和與新鮮人血清37℃孵育后放射化學純度的變化了解其穩(wěn)定性。將<'99m>Tc-EC-ODN與血漿蛋白37℃孵育測定其血漿蛋白結(jié)合率。將-20℃儲存的 EC-ODN 不于同時間取出進行<'99m>Tc標記，觀察標記率的變化了解其穩(wěn)定性。以<'99m>Tc-EC-ASODN 與互補鏈結(jié)合

3、后Sep-Pak C<,18>反相柱洗脫液放射峰的變化和PAGE電泳來觀察標記物中ASODN的活性。 第二部分靶向納米粒的制備、鑒定及其對放射性標記寡脫氧核苷酸的包載用二次超聲乳化和溶劑揮發(fā)技術(shù)制備牛血清白蛋白納米粒(BSANP)，采用激光粒徑儀測定納米粒的粒徑和分布，透射電鏡觀察納米粒形態(tài)。用化學方法連接BSANP與EGF，Sephadex G50 分離純化 EGF-BSANP，測定粒徑和分布。聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定EGF-

4、BSANP的連接情況，用<'125>Ⅰ標記EGF測定EGF-BSANP上EGF的偶聯(lián)量，以放射性定量的方法考察EGF-BSANP與BSANP的腫瘤細胞攝取。采用包裹法對放射性標記寡脫氧核苷酸進行靶向納米粒包載，10％三氯乙酸沉淀后測定包載率和不同時間點的藥物釋放率，繪制藥物釋放曲線。紙色譜層析法測定荷<'99m>Tc-EC-ODN 靶向納米粒在室溫和血清中的放射化學純度變化來觀察<'99m>Tc-EC-ODN。的穩(wěn)定性。 第三部

5、分荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對乳腺癌細胞靶向性的體外研究 1．以MDA-MB-231 細胞作為細胞對照，觀察 SK-Br3 細胞對荷<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒和未用靶向納米粒的<'99m>Tc-ODN的攝取，計算各組相應處理因素作用培養(yǎng)不同時間的細胞攝取率。 2．計算去各組相應處理因素后不同培養(yǎng)時間的細胞滯留率。 3．MTI 法測定<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒對 SK-Br3 細

6、胞和MDA-MB-231 細胞的活力影響。 4．RT-PCR 半定量分析荷<'99m>Tc-ODN 靶向納米粒對SK-Br3 細胞c-erbB2 mRNA表達的影響。 5．Western blot測定<'99m>Tc-ODN靶向納米粒對SK-Br3 細胞c-erbB2蛋白表達的影響。 第四部分荷<'99m>Tc標記c-erbB2 ASODN 靶向納米粒在小鼠體內(nèi)的分布及荷瘤裸鼠SPECT顯像：荷<'99m>Tc-

7、ASODN 靶向納米粒在正常小白鼠及荷人乳腺癌裸鼠的體內(nèi)分布，荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒在荷人乳腺癌裸鼠的 SPECT 顯像研究。 結(jié)果： 第一部分 c-erbB2 ASODN 的放射性核素標記及鑒定EC-ASODN 的 <'99m>Tc 標記率為 81.2％±7.9％，比活度為(3.1±0.7)MBq/μg。 Sephadex G25分離純化得到的第 1 放射峰即為<'99m>Tc-EC-ASO

8、DN，經(jīng)24h穩(wěn)定性分析，其放射化學純度略有降低，但24h均值大于80％。與新鮮人血清37℃孵育分析其穩(wěn)定性，經(jīng)紙層析分析測得放射化學純度4h比1h略有降低，但4h均值大于85％。 標記物與互補鏈在37℃條件下與人血清孵育60min后極性下降，反義寡脫氧核苷酸與互補鏈雜交后經(jīng)含7mol/1尿素16％PAGE膠電泳形成清晰的兩條帶。 第二部分靶向納米粒的制備、鑒定及其對放射性標記寡脫氧核苷酸的包載透射電鏡觀察，納米粒形態(tài)圓

9、整，大小較均勻。激光散射法測定的BSANP平均粒徑為 34nm，90％的粒徑小于38nm。EGF-BSANP平均粒徑為36nm，90％的粒徑小于39nm，粒徑比BSANP略為增大。 SDS-PAGE電泳示，BSANP樣品電泳條帶與Marker 68kDa接近，而EGF-BSANP樣品電泳條帶與Marker 75kDa接近。 3.種標記寡脫氧核苷酸納米粒的釋藥趨勢基本相同，均表現(xiàn)為對包載藥物的緩慢釋放。 第三部分荷

10、<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對乳腺癌細胞靶向性的體外研究 1.SK-Br3 細胞對荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒的攝取率，30min為(16.92±1.91)％，60min 達峰值(21.70±2.10)％，然后逐漸下降，在240min為(7.11±2.76)％。MDA-MB-231 細胞對非靶向納米組 <'99m>Tc-ASODN 的攝取率30min為(12.27±2.76)％，60min達峰值(13.

11、19±2.34)％，在240min為(3.70±1.91)％。SK-Br3細胞和MDA-MB-231 細胞的累積攝取率都隨時間而逐漸增加，但二者對<'99m>Tc-ASODN 的累積攝取率有較明顯的差異。 2.SK-Br3 細胞對荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米滯留率呈緩慢下降的趨勢，15min滯留率為(92.26±9.19)％，60min為(73.70±6.10)％，360min為(43.70±3.10)％；對荷 <'

12、99m>Tc-SODN 靶向納米組 15min 滯留率為(93.18±8.02)％，60min為(54.91±5.96)％，360min為(5.24±1.27)％；對荷<'99m>Tc-NSODN 靶向納米組 15min 滯留率為(92.62±9.50)％，60min為(54.91±5.96)％，360min為(4.91±1.88)％。<'99m>Tc-SODN和<'99m>Tc-NSODN靶向納米組呈快速下降趨勢，與<'99m>Tc-

13、ASODN靶向納米組有明顯差異。 3.MTT法檢測荷 <'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒對 SK-Br3 細胞和MDA-MB-231 細胞的抑制率分別為(26.5±6.4)％和(6.5±3.1)％，差異具有顯著性(P<0.01)；<'99m>Tc-ASODN對SK-Br3細胞和MDA-MB-231 細胞的抑制率分別為(14.8±3.4)％和(5.1±3.6)％，差異具有顯著性(P<0.01)。<'99m>Tc-ASODN

14、靶向納米粒和<'99m>Tc-ASODN 對 SK-Br3 細胞的抑制率差異具有顯著性(P<0.01)。 4.RT-PCR 檢測 c-erbB2 基因 mRNA 水平結(jié)果顯示：荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米組中 c-erbB2 mRNA 的表達(灰度值為60.63±3.3)，較未用靶向納米粒<'99m>Tc-ASODN組(灰度值為96.82±5.1)mRNA表達較弱，差異有顯著性(P<0.01)。 5.West

15、ern blot檢測SK-Br3細胞c-erbB2蛋白表達結(jié)果示：采用靶向納米介導<'99m>Tc-ASODN組對SK-Br3細胞c-erbB2蛋白的表達抑制率明顯高于未用靶向納米介導<'99m>Tc-ASODN組，差異有顯著性(P<0.01)。 第四部分荷<'99m>Tc標記c-erbB2 ASODN 靶向納米粒在小鼠體內(nèi)的分布及荷瘤裸鼠SPECT顯像： 1.<'99m>Tc-ASODN 與荷<'99m>Tc-ASOD

16、N 靶向納米粒在正常小鼠體內(nèi)分布：<'99m>TC-ASODN 注射后血清除迅速，荷<'99m>TC-ASODN 靶向納米粒在血中清除較緩慢，2種標記物在不同時間血中滯留量有明顯區(qū)別。 2.荷人乳腺癌裸鼠模型的體內(nèi)分布：荷<'99m>Tc-ASODN靶向納米粒的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐漸升高，在 2h 達峰值(瘤/血、瘤/肌肉比值分別為3.31±0.61、14.87±6.06)，后略有下降。<'99m>Tc-ASODN放射性

17、瘤/血、瘤/肌肉比值升降趨勢與荷<'99m>Tc-ASODN 靶向納米粒相似，但同一時間點的放射性瘤/血比值相對較低。 3.2h進行荷人乳腺癌裸鼠SPECT靜態(tài)顯像，腫瘤部位放射性濃聚，可見到較清晰的腫瘤顯像。 結(jié)論： 本研究中 ASODN 以螯合劑EC與<'99m>Tc連接，形成的EC-ASODN其標記率高，放化純高，比活度符合要求，與血漿蛋白結(jié)合率低，復合物穩(wěn)定。<'99m>Tc-EC-ASODN 中的 AS