BMSCs的膠質(zhì)瘤趨向性與TGFβ1的關(guān)系的體外研究.pdf

1、目的:
　　培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，BMSCs)、U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(human U251Glioma cell line，U251 cell line)并觀察其在體外的生長(zhǎng)特征，用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定BMSCs，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨向膠質(zhì)瘤細(xì)胞移動(dòng)的能力，并研究這種趨向性是否與腫瘤分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta1(Transforming growth factor-beta1,T

2、GFβ1)相關(guān)。
　　方法:
　　1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:用貼壁法自SD大鼠股骨、脛骨提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用完全培養(yǎng)基（低糖DMEM+10％FBS+100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素）培養(yǎng)，定期換液、傳代，觀察其形態(tài)及增殖規(guī)律，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞表面分化抗原(CD29+、CD90+、CD45-)。
　　2、U251細(xì)胞系的培養(yǎng):應(yīng)用完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10％FBS+100

3、U/ml青霉素+100μ g/ml鏈霉素）培養(yǎng)，定期換液、傳代。
　　3、TGFβ1基因在U251細(xì)胞系中的表達(dá)的檢測(cè):用Trizol法提取U251細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)TGFβ1基因在U251細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　4、U251細(xì)胞系TGFβ1因子分泌量的檢測(cè):用ELISA法檢測(cè)U251細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)上清中TGFβ1因子的濃度，并取TGFβ1濃度最高的培養(yǎng)上清作為腫瘤條件培養(yǎng)基。
　　5、U2

4、51細(xì)胞系TGFβ1基因的RNA干擾實(shí)驗(yàn)以及干擾效果檢測(cè):應(yīng)用LipofectamineTM2000與TGFβ1特異性的siRNA結(jié)合，再將復(fù)合物導(dǎo)入U(xiǎn)251細(xì)胞內(nèi)，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot法檢測(cè)RNA干擾效率。將轉(zhuǎn)染TGFβ1特異性siRNA的U251細(xì)胞組命名為siRNA組，細(xì)胞命名為U251-siRNA細(xì)胞;轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA的細(xì)胞組命名為NC組;無(wú)任何處理的U251細(xì)胞組命名為C0N組。
　　6、

5、體外遷移實(shí)驗(yàn):利用transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，設(shè)置A、B、C、D四組，transwell的上室中均加入等量的BMSCs，A組的下室中設(shè)置U251腫瘤條件培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，B組的下室中設(shè)置U251-siRNA條件培養(yǎng)基，C組下室為加入了與腫瘤條件培養(yǎng)基中濃度相當(dāng)?shù)耐庠碩GFβ1的普通培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照組，D組下室為普通培養(yǎng)基組作為陰性對(duì)照組，培養(yǎng)48h，細(xì)胞固定、染色后用光學(xué)顯微鏡觀察BMSCs向下室的遷移并拍照，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（t檢驗(yàn)

6、）與對(duì)照組做比較，以證實(shí)TGFβ1在BMSCs趨化遷移中的作用。
　　結(jié)果:
　　1、光學(xué)顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的BMSCs呈長(zhǎng)梭形、折光性強(qiáng)的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)貼壁生長(zhǎng)，表面分化抗原鑒定結(jié)果顯示BMSCs高表達(dá)CD29和CD90，不表達(dá)CD45。
　　2、U251細(xì)胞可表達(dá)TGFβ1基因，并可分泌細(xì)胞因子TGFβ1，而且在72h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其分泌量增大。U251細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)72h的培養(yǎng)上清中TGFβ1因子濃度為5

7、126.96±321.28 pg/ml，經(jīng)處理可作為較理想的膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基。
　　3、熒光定量PCR及WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比較，RNA干擾后U251細(xì)胞內(nèi)TGFβ1 mRNA以及TGFβ1因子的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。
　　4、transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與普通培養(yǎng)基相比較，U251腫瘤條件培養(yǎng)基(CM)可以顯著吸引BMSCs的定向遷移(P＜0.05);單加入人源TGFβ1因子的培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比也具有吸引B

8、MSCs的定向遷移的能力(P＜0.05)，但比U251CM弱;經(jīng)人TGFβ1特異性siRNA干擾后的U251-siRNA CM對(duì)BMSCs的趨化作用與干擾前相比有明顯減弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、貼壁法可自SD大鼠股骨、脛骨骨髓分離培養(yǎng)純度較高BMSCs，并且較為經(jīng)濟(jì)方便;
　　2、U251細(xì)胞可表達(dá)TGFβ1基因并分泌一定量的TGFβ1因子;
　　3、RNA干擾后U251細(xì)胞內(nèi)TGFβ1mRNA以