可溶性鈣網(wǎng)蛋白片段39-272對中國倉鼠卵巢細胞體內(nèi)成瘤性的影響及其機制研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是一個定位于內(nèi)質網(wǎng)中的多功能蛋白，全長CRT具有416個氨基酸序列，約46kDa，N端有一個17個氨基酸的信號序列，C端有KDEL的內(nèi)質網(wǎng)滯留信號序列。CRT具有N，P和C三個結構域。其中P和C結構域具有超強的結合Ca2+能力，維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，參與Ca2+介導的信號通路。此外，CRT在內(nèi)質網(wǎng)中行使其分子伴侶的功能，通過N-domain的凝集素結合序列保證新合成蛋白的正確折疊。越來越多的證

2、據(jù)表明CRT在細胞膜上也發(fā)揮著重要的生物學功能，包括介導細胞粘附，參與凋亡細胞清除等。此外，病理狀況下體液中可溶性CRT的存在也屢見報道，包括自身免疫病、腫瘤等。
　　臨床以及實驗室的數(shù)據(jù)都提示CRT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，主要體現(xiàn)在：1）CRT在腫瘤組織中高表達或在體液中出現(xiàn)對于腫瘤具有一定的輔助診斷價值；2）高表達CRT的腫瘤細胞轉移能力更強；3）可溶性CRT抑制腫瘤血管新生；4）膜型CRT介導腫瘤細胞免疫原性死亡（immu

3、nogenic death）。本實驗室的前期工作顯示，原核表達CRT片段39-272（rCRT/39-272）具有較強的免疫刺激活性及佐劑效應。本課題的主要內(nèi)容是圍繞CRT與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，結合其對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，利用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞株考察可溶性CRT對細胞體內(nèi)成瘤性的影響并探索其機制。
　　我們構建了eCRT/39-272的真核表達載體，并獲得了持續(xù)分泌 eCRT/39-272的穩(wěn)轉細胞株，從培養(yǎng)上清中用鎳柱純

4、化得到真核重組表達的eCRT/39-272。體外實驗表明，eCRT/39-272可刺激小鼠腹腔巨噬細胞(PMC)分泌炎性因子 TNF-α、IL-6，NO，且其發(fā)揮功能依賴于TLR4所介導的信號通路。
　　對持續(xù)分泌eCRT/39-272的CHO細胞株及其對照細胞株體外成瘤指標考察發(fā)現(xiàn)分泌eCRT/39-272不影響CHO細胞體外的增殖速度、克隆形成能力，但增強了CHO細胞的粘附和遷移能力。與裸鼠皮下接種CHO-eCRT/39-27

5、2及其對照細胞CHO-EGFP，CHO-eCRT/39-272成瘤率顯著高于CHO-EGFP，且腫瘤體積比CHO-EGFP大約二倍。進一步的研究表明裸鼠左右兩側皮下同時接種CHO-eCRT/39-272和CHO-EGFP，血清中存在的eCRT/39-272并不促進CHO-EGFP腫瘤的生長。分析荷瘤小鼠外周血以及脾臟中的B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓來源的抑制細胞（MDSC）、自然殺傷細胞比例，發(fā)現(xiàn)并無明顯差異。對腫瘤組織局部浸潤的

6、免疫細胞進行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織局部的MDSC細胞比例顯著增加，提示其可能參與了體內(nèi)腫瘤的生長。同時對腫瘤組織局部進行細胞因子表達檢測，發(fā)現(xiàn)與MDSC遷移相關的趨化因子CCL5上調(diào)，并且非免疫系統(tǒng)依賴的效應分子金屬基質蛋白酶MMP-2表達增加。
　　綜上所述，與前期描述的CRT作為血管抑素抑制腫瘤生長的作用不同，持續(xù)分泌表達eCRT/39-272的CHO細胞體內(nèi)成瘤性顯著增強，這種促腫瘤的作用可能與腫瘤局部高濃度eCRT/39-27