可溶性纖維連接蛋白對SGC-7901細胞中PKA活性的影響及其機制的探究.pdf

1、研究目的:
　　 本研究通過向SGC-7901細胞中加入可溶性纖維連接蛋白(fibronectin,FN)以及蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活劑等探討可溶性纖維連接蛋白對PKA活性的影響并初步分析其機制,并進一步研究可溶性FN對PKA相關(guān)的功能的影響。
　　 研究內(nèi)容:
　　 (1)實驗采用蛋白印跡技術(shù)檢測SGC-7901細胞中可溶性FN在不同濃度及作用時間情況下對PKA Cα亞基表達水

2、平以及PKA作用底物血管擴張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)磷酸化水平的影響；
　　 (2)檢測FN能否抑制由不同PKA激活劑活化的PKA,初步確定FN在cAMP／PKA信號通路中的作用位點；
　　 (3)采用免疫熒光技術(shù)檢測可溶性FN對PKA作用底物p-VASP分布的影響；
　　 (4)wtHt31質(zhì)粒和GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入SGC-7901細胞,建

3、立了能夠穩(wěn)定表達人甲狀腺A激酶錨定蛋白(human thyroid AKAP,Ht31)肽段的SGC細胞,探討破壞PKA錨定后FN對PKA活性的影響是否發(fā)生變化;
　　 (5)采用鬼筆環(huán)肽染色法檢測FN對正常SGC-7901細胞以及轉(zhuǎn)染Ht31肽段的SGC細胞中的細胞骨架的影響；
　　 (6)利用細胞刮除-損傷實驗在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況,檢測不同實驗條件下SGC-7901細胞遷移行為的變化。
　　 實驗結(jié)

4、果:
　　 (1)在SGC-7901細胞中,選取1μg／ml可溶性FN作用12 h以后,可溶性FN對PKA活性存在時間依賴性抑制效應(yīng)；可溶性FN在0.5-8μg／ml濃度區(qū)間內(nèi)作用24 h以后,對PKA活性存在劑量依賴性抑制效應(yīng)；
　　 (2)可溶性FN可以抑制Forskolin引起的PKA活化,不能抑制外源性CPT-cAMP引起的PKA活化；
　　 (3)Ht31破壞PKA錨定后,FN對PKA活性的抑制作用消失

5、；
　　 (4)免疫熒光顯示可溶性FN可以使VASP磷酸化位置聚集于細胞邊緣；
　　 (5)Forskolin抑制可溶性FN在正常SGC-7901細胞邊緣處使應(yīng)激纖維聚集的作用,轉(zhuǎn)染wtHt31肽段的SGC細胞這種抑制作用被取消；
　　 (6)可溶性FN能夠拮抗PKA活化導(dǎo)致的細胞遷移抑制,這一作用受PKA錨定影響。
　　 結(jié)論:
　　 綜合以上實驗結(jié)果,我們認為在SGC-7901細胞中可溶性FN