可溶性ST2融合蛋白對小鼠肝臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、一、ST2與缺血/再灌注損傷相關(guān)
　　 缺血/再灌注損傷(I/R，Ischemia and reperfusion)是指缺血缺氧的組織器官重新獲得血液供應(yīng)后，往往并不能使損傷減輕或恢復(fù)，反而加重組織器官功能障礙、結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。在肝臟移植、外傷、休克以及部分肝切除手術(shù)過程中，通常會發(fā)生短時間肝臟缺血、缺氧。肝臟缺血/再灌注損傷所引發(fā)的復(fù)雜病理生理學(xué)改變包括缺血直接導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，以及相關(guān)炎癥信號通路激活所致組織器官失功

2、和破壞。肝臟缺血/再灌注損傷發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全明確，近年來，與組織器官損傷相關(guān)的炎癥反應(yīng)引起廣泛關(guān)注。
　　 目前已知，肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer 細(xì)胞)激活后產(chǎn)生ROS，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞NOS活性上升、活化JNK信號途徑、上調(diào)炎性細(xì)胞因子表達(dá)并伴隨中性粒細(xì)胞局部浸潤等，由此促進(jìn)炎癥反應(yīng)相關(guān)的組織細(xì)胞損傷。初始細(xì)胞損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)大，繼而促進(jìn)組織細(xì)胞損傷加重，其確切機(jī)制尚未完全明確。近年對此提出新觀點：組織細(xì)胞起始破壞及

3、炎癥信號途徑激活，可能與局部缺血組織或細(xì)胞間基質(zhì)損傷所釋放(內(nèi)源性)損傷/危險相關(guān)分子模式信號(damage/danger associated molecular pattern，DAMP)有關(guān)。
　　 天然免疫細(xì)胞表面Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是脊柱動物識別病原體感染最原始的一種方式，其通過識別、結(jié)合特異性分子模式而啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)和

4、多種生物學(xué)效應(yīng)。TLR在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答間發(fā)揮重要的橋梁作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，TLR識別的分子模式不僅包括病原微生物(及其產(chǎn)物)所共有的某些非特異性、高度保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)，如脂多糖(LPS)、磷壁酸(LTA)、肽聚糖、細(xì)菌DNA、雙鏈RNA等，還包括組織細(xì)胞損傷破壞時所釋放的一系列內(nèi)源性“危險信號”，如熱休克蛋白(HSP)、氧自由基、核甘酸、

5、神經(jīng)介質(zhì)、白介素等。
　　 肝臟由實質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)和非實質(zhì)細(xì)胞(包括Kupffer細(xì)胞、DC、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞)組成。近年報道，肝細(xì)胞和肝臟非實質(zhì)細(xì)胞表面普遍表達(dá)低水平TLR4。相對其他TLR，TLR4處于病原微生物感染和無菌性炎癥反應(yīng)的交界面，更易接受細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)和內(nèi)源性配體信號的刺激。Billiar等證實，肝臟缺血/再灌注過程中，肝臟非實質(zhì)細(xì)胞表面TLR4可識別損傷/壞死細(xì)胞所釋放的多種內(nèi)源性配體，如HSP 60

6、/70、纖維蛋白原、纖粘連蛋白、肝磷脂硫酸鹽和高遷移率家族蛋白(high-mobility group box-1，HMGB1)等，并在介導(dǎo)肝臟再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。
　　 ST2(又命名為T1、DER4)最初被發(fā)現(xiàn)是由小鼠成纖維細(xì)胞所分泌，屬IL-1受體超家族。St2基因定位于小鼠1號染色體和人類2號染色體并與IL-1R區(qū)基因緊密相鄰。ST2分子結(jié)構(gòu)類似于IL-1受體，但其不與IL-1家族成員(如IL-1α、IL-1β或I

7、L-1R拮抗劑)結(jié)合。St2基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)不同方式剪接修飾，生成(2.7 kb和5kb)兩種mRNA序列，翻譯后生成相應(yīng)蛋白分子，即短序列分泌型ST2(可溶性ST2或sST2)和長序列跨膜型ST2(ST2L)。可溶性ST2與跨膜型ST2胞外段序列基本一致，僅在C末端存在9個氨基酸序列差異?？扇苄許T2由成纖維細(xì)胞分泌，跨膜型ST2表達(dá)于肥大細(xì)胞和Th2型細(xì)胞表面，參與Th2型應(yīng)答。近年在胃、小腸、結(jié)腸等組織發(fā)現(xiàn)一種新的剪接體，

8、編碼一類新的跨膜型ST2蛋白，但其功能特征有待進(jìn)一步研究。
　　 ST2參與細(xì)胞生長調(diào)控和胚胎發(fā)育，其在造血細(xì)胞系中表達(dá)并與Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)相似，提示可能參與免疫應(yīng)答及其調(diào)控。應(yīng)用抗ST2抗體處理BABL/C小鼠，能誘導(dǎo)Th2型應(yīng)答向Th1型應(yīng)答偏移，從而抑制利什曼原蟲感染；膠原質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎主要為Th1型應(yīng)答，經(jīng)抗ST2抗體處理可加重炎性細(xì)胞浸潤和關(guān)節(jié)炎損傷；抗ST2抗體、ST2融合蛋白處理過敏性肺炎、血吸蟲卵感

9、染和呼吸道合胞病毒感染等動物模型，以及ST2基因敲除小鼠體內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)ST2L可促進(jìn)Th2型應(yīng)答，主要表現(xiàn)為特征性嗜酸粒細(xì)胞局部浸潤和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13表達(dá)水平上升。
　　 Xu等探討可溶性ST2-IgG融合蛋白對LPS激活巨噬細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)可溶性ST2可下調(diào)巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，顯著降低炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12等分泌，其機(jī)制是ST2與細(xì)胞表面相應(yīng)ST2配體(ST2 BP)結(jié)合，

10、向胞內(nèi)傳遞抗炎信號，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生；體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，給予ST2融合蛋白可降低小鼠內(nèi)毒素休克死亡率?？扇苄許T2通過與相應(yīng)配體結(jié)合而下調(diào)炎性信號的分子機(jī)制尚未明確，但其抗炎作用涉及細(xì)胞表面受體識別LPS和相應(yīng)炎性信號通路。TLR 4是LPS特異性受體，可通過胞內(nèi)轉(zhuǎn)接蛋白MyD88依賴性和非依賴性途徑傳遞炎性信號，在激活巨噬細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與識別組織細(xì)胞損傷/破壞而釋放的多種內(nèi)源性配體。
　　 上述研究進(jìn)展提示：肝臟

11、缺血/再灌注所引發(fā)無菌性炎癥反應(yīng)和組織細(xì)胞損傷過程中，ST2可能對肝臟Kupffer細(xì)胞活性發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，該效應(yīng)可能涉及TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本課題研究目標(biāo)為：克隆小鼠可溶性ST2基因，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，制備可溶性ST2-Fc融合蛋白；體外觀察sST2-Fc融合蛋白對LPS激活巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子的影響；體內(nèi)轉(zhuǎn)染sST2-Fc真核表達(dá)載體，觀察sST2-Fc對小鼠肝臟缺血/再灌注損傷的影響，并探討其機(jī)制，為今后應(yīng)用于臨床治療組

12、織器官缺血/再灌注損傷和相關(guān)炎癥性疾病提供實驗依據(jù)。
　　 二、小鼠可溶性ST2和人IgG Fc基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 分別從小鼠脾臟和人外周血單個核細(xì)胞提取總RNA。利用RT-PCR技術(shù)獲得編碼小鼠可溶性ST2和人IgG Fc的cDNA，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA 3.1，構(gòu)建重組載體pcDNA 3.1-sST2-IgG Fc(psST2-Fc)。經(jīng)酶切鑒定及測序分析證實，所克隆和構(gòu)建的sST2-Fc

13、cDNA閱讀框及連接部位序列正確，表明小鼠可溶性ST2和人IgG Fc融合基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 三、可溶性ST2-Fc融合蛋白的制備及其體外效應(yīng)的研究
　　 1.可溶性ST2-Fc基因表達(dá)和鑒定采用Lipofectamine TM 2000將psST2-Fc載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)可溶性ST2-Fc融合蛋白；采用Western blot、ELISA檢測CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中所表達(dá)sST2-Fc融合蛋白

14、，用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品對sST2-Fc進(jìn)行定量檢測；采用RT-PCR檢測psST2-Fc融合基因mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染psST2-Fc的CHO細(xì)胞可表達(dá)sST2-Fc融合基因mRNA，在約929 bp處呈現(xiàn)一明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；收集轉(zhuǎn)染psST2-Fc的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液，借助Protein A sepharose CL-4B親和層析柱純化sST2-Fc融合蛋白，可與抗小鼠ST2單克隆抗體特異性結(jié)合形成一明顯條帶，其分子量

15、約100 kDa，與預(yù)期結(jié)果相一致。
　　 2.FACS檢測sST2-Fc融合蛋白與相應(yīng)配體結(jié)合為檢測sST2-Fc融合蛋白與相應(yīng)配體結(jié)合能力，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和sST2-Fc融合蛋白作用后，用FITC標(biāo)記的羊抗人IgG Fc抗體染色。FACS結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞表面表達(dá)ST2的特異性配體，并在LPS刺激下表達(dá)升高。
　　 3.sST2-Fc對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響采用ELISA檢測sST2-Fc融合蛋白對LPS刺激巨

16、噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。結(jié)果表明，sST2-Fc融合蛋白能明顯抑制LPS刺激腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6的作用。
　　 四、sST2-Fc對肝臟缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的實驗研究
　　 建立BALB/C小鼠肝臟缺血/再灌注模型，在預(yù)定時間點取材進(jìn)行檢測，同時設(shè)立假手術(shù)對照組。
　　 五、結(jié)論
　　 1.缺血/再灌注動物模型中，可溶性ST2可有效抑制肝臟巨噬細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-