慢病毒過表達可溶性ST2蛋白對小鼠肺纖維化的抑制作用.pdf

1、目的：
　　白細胞介素(interleukin，IL)-33是IL-1家族的新成員，而可溶性ST2(soluble ST2，sST2)是IL-33的一個誘餌受體，IL-33主要通過IL-33/ST2信號通路在疾病中發(fā)揮生物學(xué)功能。肺纖維化疾病是由多種病因?qū)е碌姆尾坷w維化的統(tǒng)稱，它包括特發(fā)性肺纖維化、過敏性肺炎、間質(zhì)性肺炎、結(jié)節(jié)病、塵肺、藥物或放射線等引起的肺纖維化。它是因為成纖維細胞大量聚集、胞外間質(zhì)沉積并且伴有炎癥反應(yīng)和損傷，導(dǎo)

2、致的肺組織結(jié)構(gòu)破壞。對于該疾病目前國內(nèi)外仍然沒有有效的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化病人和博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型體內(nèi)sST2和IL-33的表達均升高。因此，本研究擬構(gòu)建慢病毒表達載體過表達可溶性ST2蛋白，研究ST2在小鼠肺纖維化中的作用及機制。
　　方法：
　　1.設(shè)計引物從pcDNA3.1-mST2質(zhì)粒中擴增出全長的小鼠ST2基因，然后將ST2目的基因與 pLVX-IRES-ZsGreen1載體用 Xho

3、I和BamH I限制性內(nèi)切酶切割，再將pLVX-IRES-ZsGreen1載體大片段和ST2基因回收后，用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，構(gòu)建pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1慢病毒表達載體。
　　2.將構(gòu)建的pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1重組質(zhì)粒與慢病毒包裝所需的三個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到人腎胚(human embryonic kidney，HEK)293T細胞中，進行ST2慢病毒包裝，并測定病毒的

4、滴度及活性。
　　3.建立博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型，將包裝的ST2慢病毒上清濃縮后用鼻滴的方法注射到模型小鼠體內(nèi)，在注射博萊霉素后第7天和第28天分別處死部分小鼠，收集樣本，研究ST2對小鼠肺纖維化的影響。通過HE染色檢測小鼠肺部炎癥的變化；用天狼猩紅染色和羥脯氨酸含量檢測小鼠肺組織纖維化和膠原纖維含量的變化；通過RT-PCR和ELISA方法檢測相關(guān)細胞因子及趨化因子含量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.通過PCR成功

5、擴增出了小鼠ST2全長序列，將其插入到pLVX-IRES-ZsGreen1多克隆位點中，成功構(gòu)建了pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1慢病毒表達載體。
　　2.將重組質(zhì)粒pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，成功包裝出了ST2慢病毒，將其濃縮后滴度可達1011TU/mL，并且該病毒可以在真核細胞中表達ST2。
　　3.將ST2慢病毒注射到小鼠體內(nèi)后，可以在小鼠肺組織中過表

6、達可溶性ST2蛋白。小鼠的肺部炎癥明顯得到緩解，其纖維化程度也較模型組減輕。第7天時ST2使小鼠肺組織中TNF-αmRNA和蛋白、MMP9 mRNA的表達增加，使IL-4，IL-6和IL-13 mRNA的表達量降低。第28天時ST2使MCP-1和MMP12 mRNA的表達降低。另外，注射ST2慢病毒后，小鼠IFN-γmRNA的表達水平在第7天和第28天時均升高。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了ST2慢病毒表達載體，將其包裝成慢病