模式識別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中作用的研究.pdf

1、背景
　　 葡萄膜炎是指累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管和玻璃體的一大類炎癥性疾病的總稱。根據(jù)葡萄膜炎病因及臨床表現(xiàn)不同，可將其分為100余種。葡萄膜炎多發(fā)于青壯年，表現(xiàn)為慢性或反復發(fā)作的眼部炎癥，且其造成的眼組織損害是不可逆的，可導致不可逆性盲目。Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征是我國各種葡萄膜炎中最為常見也是致盲率最高的葡萄膜炎類型。目前認為，Behcet病為一種自身炎癥性疾病，而Vogt-小柳原田綜合征為一種自身免疫

2、性疾病。兩者的病因目前還不清楚，但感染和免疫反應(yīng)被認為均參與了兩種疾病的發(fā)生。模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRR)是固有免疫的重要組成部分，在機體抵抗外來微生物感染中發(fā)揮了重要的作用。模式識別受體在接觸到外來微生物后可以將其轉(zhuǎn)化為適應(yīng)性免疫，激活免疫細胞，促進炎癥因子釋放，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)消除外來微生物。但是，模式識別受體表達及功能的異?？梢詫е旅庖呦到y(tǒng)紊亂，從而導致疾病的發(fā)生。
　　

3、 本研究正是基于上述背景，進行了以下兩大方面的實驗:1、探討模式識別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征患者中的表達，以期尋找到差異表達的模式識別受體。2、進一步探討差異表達的模式識別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中所起的作用。通過上述研究，以期能對以上兩種疾病的發(fā)病機制有一個深入的了解，同時為其預防和治療尋找到新的靶點和突破口。
　　 第一部分模式識別受體在Behcet病發(fā)病中作用的研究

4、　　 目的:
　　 探討模式識別受體在Behcet病發(fā)病中的作用。
　　 方法:
　　 分別抽取活動期Behcet病患者、靜止期的Behcet病患者、急性前葡萄膜炎患者(acute anterior uveitis，AAU)和正常人外周靜脈血，分離單核細胞并誘導為外周血單核細胞誘導的巨噬細胞(monocyte-derived macrophages，MDMs)。使用熒光定量PCR技術(shù)及流式細胞技術(shù)檢測TLR2/

5、4的表達;使用ELISA方法檢測IL-1β表達水平;使用流式細胞技術(shù)檢測線粒體受損及活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)產(chǎn)生水平;使用基因沉默技術(shù)使NLRP3低表達;使用流式細胞技術(shù)評價MAPK信號通路磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.活動期Behcet病患者MDMs細胞TLR2和TLR4表達明顯高于靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。
　　 2.活動期Behcet病患者

6、MDMs產(chǎn)生IL-1β水平明顯高于靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。PGN和LPS刺激MDMs后，可以明顯升高各組IL-1β產(chǎn)生水平。但是，活動期Behcet病患者IL-1β升高水平明顯高于其它各實驗組，其它各實驗組之間無明顯差異。
　　 3.活動期Behcet病患者體內(nèi)MDMs細胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平與靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人相比明顯升高;PGN和LPS可以使各組MDMs細胞線粒體受損及R

7、OS產(chǎn)生水平明顯增高，并且活動期Behcet病患者升高水平明顯高于其它組;anti-TLR2/anti-TLR4可以明顯降低PGN/LPS對MDMs細胞線粒體損傷和ROS產(chǎn)生作用;rotenone可以明顯升高MDMs細胞ROS產(chǎn)生水平及IL-13分泌水平，而DPI可以明顯降低MDMs細胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β分泌水平。
　　 4.基因沉默炎癥小體NLRP3后，各組IL-1β產(chǎn)生顯著降低。
　　 5.ROS通過激活p3

8、8和ERK1/2，進而激活炎癥小體NLRP3，從而使IL-1β產(chǎn)生增多。
　　 結(jié)論:
　　 我們的結(jié)果顯示:TLR2/4在活動期Behcet病患者MDMs細胞中表達明顯升高。TLR2/4與其配體PGN/LPS相互作用可以使線粒體產(chǎn)生ROS增多，進而激活炎癥小體NLRP3，從而使IL-1β產(chǎn)生增多引起炎癥反應(yīng)。
　　 第二部分模式識別受體在Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中作用的研究
　　 目的:
　　

9、 探討模式識別受體在Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中所起的作用。
　　 方法:
　　 分別抽取活動期Vogt-小柳原田綜合征患者、靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人外周靜脈血，分離單核細胞并誘導為巨噬細胞。使用熒光定量PCR技術(shù)及流式細胞技術(shù)檢測TLR2/3/4的表達;使用ELISA方法檢測IL-1β表達水平;使用流式細胞技術(shù)檢測線粒體受損及活性氧簇(ROS)產(chǎn)生水平;使用基因沉默技術(shù)使NLRP3低表

10、達;使用流式細胞技術(shù)評價MAPK信號通路磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.活動期Vogt-小柳原田綜合征患者MDMs細胞TLR3和TLR4表達明顯高于靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人;TLR2表達在各組之間無明顯差異。
　　 2.活動期Vogt-小柳原田綜合征患者MDMs產(chǎn)生IL-1β水平明顯高于靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人。Poly I:C和LPS刺激MDMs

11、后，可以明顯升高各組IL-1β產(chǎn)生水平。但是，活動期Vogt-小柳原田綜合征患者IL-1β升高水平明顯高于其它各實驗組，其它各實驗組之間無明顯差異。
　　 3.活動期Vogt-小柳原田綜合征患者體內(nèi)MDMs細胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平與靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人相比明顯升高;poly I:C和LPS可以使各組MDMs細胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平明顯增高，并且活動期Vogt-小柳原田綜合征患者升高水

12、平明顯高于其它組;anti-TLR3/anti-TLR4可以明顯降低poly I:C/LPS對MDMs細胞線粒體損傷和ROS產(chǎn)生的作用;rotenone可以明顯升高MDMs細胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β產(chǎn)生水平，而DPI可以明顯降低MDMs細胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β產(chǎn)生水平。
　　 4.基因沉默炎癥小體NLRP3后，各組IL-1β產(chǎn)生水平顯著降低。
　　 5.ROS通過激活p38和ERK1/2信號通路進而激活炎癥小體