模式識(shí)別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中作用的研究.pdf

1、背景
　　 葡萄膜炎是指累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管和玻璃體的一大類炎癥性疾病的總稱。根據(jù)葡萄膜炎病因及臨床表現(xiàn)不同，可將其分為100余種。葡萄膜炎多發(fā)于青壯年，表現(xiàn)為慢性或反復(fù)發(fā)作的眼部炎癥，且其造成的眼組織損害是不可逆的，可導(dǎo)致不可逆性盲目。Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征是我國(guó)各種葡萄膜炎中最為常見也是致盲率最高的葡萄膜炎類型。目前認(rèn)為，Behcet病為一種自身炎癥性疾病，而Vogt-小柳原田綜合征為一種自身免疫

2、性疾病。兩者的病因目前還不清楚，但感染和免疫反應(yīng)被認(rèn)為均參與了兩種疾病的發(fā)生。模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRR)是固有免疫的重要組成部分，在機(jī)體抵抗外來(lái)微生物感染中發(fā)揮了重要的作用。模式識(shí)別受體在接觸到外來(lái)微生物后可以將其轉(zhuǎn)化為適應(yīng)性免疫，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子釋放，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)消除外來(lái)微生物。但是，模式識(shí)別受體表達(dá)及功能的異常可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
　　

3、 本研究正是基于上述背景，進(jìn)行了以下兩大方面的實(shí)驗(yàn):1、探討模式識(shí)別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征患者中的表達(dá)，以期尋找到差異表達(dá)的模式識(shí)別受體。2、進(jìn)一步探討差異表達(dá)的模式識(shí)別受體在Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中所起的作用。通過(guò)上述研究，以期能對(duì)以上兩種疾病的發(fā)病機(jī)制有一個(gè)深入的了解，同時(shí)為其預(yù)防和治療尋找到新的靶點(diǎn)和突破口。
　　 第一部分模式識(shí)別受體在Behcet病發(fā)病中作用的研究

4、　　 目的:
　　 探討模式識(shí)別受體在Behcet病發(fā)病中的作用。
　　 方法:
　　 分別抽取活動(dòng)期Behcet病患者、靜止期的Behcet病患者、急性前葡萄膜炎患者(acute anterior uveitis，AAU)和正常人外周靜脈血，分離單核細(xì)胞并誘導(dǎo)為外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophages，MDMs)。使用熒光定量PCR技術(shù)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)TLR2/

5、4的表達(dá);使用ELISA方法檢測(cè)IL-1β表達(dá)水平;使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)線粒體受損及活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)產(chǎn)生水平;使用基因沉默技術(shù)使NLRP3低表達(dá);使用流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)價(jià)MAPK信號(hào)通路磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.活動(dòng)期Behcet病患者M(jìn)DMs細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)明顯高于靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。
　　 2.活動(dòng)期Behcet病患者

6、MDMs產(chǎn)生IL-1β水平明顯高于靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。PGN和LPS刺激MDMs后，可以明顯升高各組IL-1β產(chǎn)生水平。但是，活動(dòng)期Behcet病患者IL-1β升高水平明顯高于其它各實(shí)驗(yàn)組，其它各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異。
　　 3.活動(dòng)期Behcet病患者體內(nèi)MDMs細(xì)胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平與靜止期Behcet病患者、AAU患者和正常人相比明顯升高;PGN和LPS可以使各組MDMs細(xì)胞線粒體受損及R

7、OS產(chǎn)生水平明顯增高，并且活動(dòng)期Behcet病患者升高水平明顯高于其它組;anti-TLR2/anti-TLR4可以明顯降低PGN/LPS對(duì)MDMs細(xì)胞線粒體損傷和ROS產(chǎn)生作用;rotenone可以明顯升高M(jìn)DMs細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平及IL-13分泌水平，而DPI可以明顯降低MDMs細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β分泌水平。
　　 4.基因沉默炎癥小體NLRP3后，各組IL-1β產(chǎn)生顯著降低。
　　 5.ROS通過(guò)激活p3

8、8和ERK1/2，進(jìn)而激活炎癥小體NLRP3，從而使IL-1β產(chǎn)生增多。
　　 結(jié)論:
　　 我們的結(jié)果顯示:TLR2/4在活動(dòng)期Behcet病患者M(jìn)DMs細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。TLR2/4與其配體PGN/LPS相互作用可以使線粒體產(chǎn)生ROS增多，進(jìn)而激活炎癥小體NLRP3，從而使IL-1β產(chǎn)生增多引起炎癥反應(yīng)。
　　 第二部分模式識(shí)別受體在Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中作用的研究
　　 目的:
　　

9、 探討模式識(shí)別受體在Vogt-小柳原田綜合征發(fā)病中所起的作用。
　　 方法:
　　 分別抽取活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者、靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人外周靜脈血，分離單核細(xì)胞并誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。使用熒光定量PCR技術(shù)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)TLR2/3/4的表達(dá);使用ELISA方法檢測(cè)IL-1β表達(dá)水平;使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)線粒體受損及活性氧簇(ROS)產(chǎn)生水平;使用基因沉默技術(shù)使NLRP3低表

10、達(dá);使用流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)價(jià)MAPK信號(hào)通路磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者M(jìn)DMs細(xì)胞TLR3和TLR4表達(dá)明顯高于靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人;TLR2表達(dá)在各組之間無(wú)明顯差異。
　　 2.活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者M(jìn)DMs產(chǎn)生IL-1β水平明顯高于靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人。Poly I:C和LPS刺激MDMs

11、后，可以明顯升高各組IL-1β產(chǎn)生水平。但是，活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者IL-1β升高水平明顯高于其它各實(shí)驗(yàn)組，其它各實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異。
　　 3.活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者體內(nèi)MDMs細(xì)胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平與靜止期Vogt-小柳原田綜合征患者、AAU患者和正常人相比明顯升高;poly I:C和LPS可以使各組MDMs細(xì)胞線粒體受損及ROS產(chǎn)生水平明顯增高，并且活動(dòng)期Vogt-小柳原田綜合征患者升高水

12、平明顯高于其它組;anti-TLR3/anti-TLR4可以明顯降低poly I:C/LPS對(duì)MDMs細(xì)胞線粒體損傷和ROS產(chǎn)生的作用;rotenone可以明顯升高M(jìn)DMs細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β產(chǎn)生水平，而DPI可以明顯降低MDMs細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平及IL-1β產(chǎn)生水平。
　　 4.基因沉默炎癥小體NLRP3后，各組IL-1β產(chǎn)生水平顯著降低。
　　 5.ROS通過(guò)激活p38和ERK1/2信號(hào)通路進(jìn)而激活炎癥小體