生長抑素受體在肝癌細(xì)胞的表達(dá)及動物模型中的分子顯像研究.pdf

1、據(jù)報道，發(fā)達(dá)國家排在死亡率第一位的是心血管疾病，惡性腫瘤排在第二位；而在我們國家，惡性腫瘤的死亡率排在第一位，其中原發(fā)性肝癌(Primary LiverCarcinoma，PLc)的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第三位，對其治療尚存在許多困難，較為有效的治療手段是手術(shù)切除。在可切除的原發(fā)性肝癌患者中五年生存率是40％左右，但是，由于手術(shù)適應(yīng)癥的限制以及腫瘤分期等因素的影響，能進(jìn)行手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌不足25％(有文獻(xiàn)報道是10％左右)。對于大多數(shù)

2、原發(fā)性肝癌尤其是中晚期肝癌患者來說，主要的治療手段是保守治療，如放射治療、介入治療、激素治療、藥物治療等。在非手術(shù)的肝癌患者中，肝動脈介入栓塞化療(TACE)有可能使病人緩解、存活期延長，其1-3年生存率分別為51％、28％和13％。放射治療對于原發(fā)性肝癌治療的適應(yīng)癥較為廣泛，不受解剖部位的限制，也不受腫瘤是多個或彌漫病灶的限制，是治療原發(fā)性肝癌的重要手段之一。一般認(rèn)為，肝癌是放射不敏感的惡性腫瘤，根治劑量非常大(據(jù)估計要≥60Gy)。

3、這個劑量超過了正常肝組織的耐受量，況且多數(shù)臨床就診病人除了分期較晚往往多合并不同程度的肝硬化，給予大體積的高劑量放射易產(chǎn)生放射性肝炎。由于正常肝耐受量劑量的限制，肝癌的放射治療只能起到抑制腫瘤的姑息作用。因此，用玻璃微球為載體的內(nèi)放射治療曾風(fēng)行一時，試圖解決外放療劑量和保護(hù)正常肝組織的治療矛盾，經(jīng)過數(shù)年臨床實踐，發(fā)現(xiàn)由于放射性核素不是直接與癌細(xì)胞結(jié)合，核素不能“內(nèi)化”，在腫瘤組織中射線難以透射，所以這一治療方法仍存在放射劑量不足的問題，

4、同時還存在玻璃微球可能沉積到肺、腎等正常組織造成小動脈栓塞的缺陷，所以臨床應(yīng)用并不廣泛。非標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)用于治療肝癌可以使試驗動物腫瘤縮小，生存期延長首先由Nakaizumi A.和Schinded D.T.分別進(jìn)行的肝癌的誘癌和移植癌動物實驗所證實。1998年，Kouroumalis等首次在一臨床隨機試驗中證明奧曲肽能明顯增加晚期不能切除的原發(fā)性肝癌患者的生存率(一年生存率56％)，使晚期肝癌患者的臨床癥狀改善、生

5、存期延長以及提高生存質(zhì)量。誠然，在原發(fā)性肝癌的早期可以提高患者治愈的可能性，真正做到“三早”，即：早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。但是，在我國肝癌發(fā)病率居高不下，當(dāng)然發(fā)生這種現(xiàn)象的因素很多，不過，筆者認(rèn)為缺乏有效、無創(chuàng)、方便、經(jīng)濟的診斷方法是一個非常重要的原因。因此，我們有必要發(fā)明一種有效的診斷、治療技術(shù)來為患者服務(wù)。生長抑素(Somatostatin，SS/SST)是一種具有廣泛生物活性的激素，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腸道、胃及胰腺等組

6、織內(nèi)，在機體功能調(diào)節(jié)與某些疾病的發(fā)病機制中都發(fā)揮著重要作用。生長抑素也與其他激素的作用途徑一樣，是通過生長抑素受體(Somatostatin Receptors，SSTR)而發(fā)揮其生理及抗腫瘤作用的?，F(xiàn)已了解SSTR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，介導(dǎo)著生長抑素的多種生物功能。SSTR定位于細(xì)胞膜，有七個跨膜區(qū)組成。SSTR由五個非等位基因編碼，位于五個不同的染色體，形成了由5種受體亞型組成的SSTR家族，即SSTR1-5。其中SSTR2又存在

7、SSTR2A與SSTR2B兩種變異體，目前對SSTR2B的功能尚不清楚。SST主要通過與細(xì)胞表面的SST受體(SSTR)結(jié)合，然后活化受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用。經(jīng)研究證實，人類SSTR，是一種G蛋白偶聯(lián)型受體，由7個跨膜糖蛋白組成。SSTR家族包括5個亞型，即SSTR-1～5.根據(jù)氨基酸序列同源性的高低和與此相關(guān)配體的選擇性及功能應(yīng)答的相似性，將SSTR家族分為兩大亞族：(1)SSTR-1、4；(2)SSTR-2、3、5。根據(jù)

8、細(xì)胞類型不同，這五種受體亞型通過GTP結(jié)合蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，它們分別通過偶聯(lián)酪氨酸磷脂酶(SSTR1.2)、K+-Ca2+通道(SSTR2)、Na+-H+交換(sSTRl)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ErK1/2)、磷脂酶A2和MAP激酶(SSTR4)等不同的信號傳遞途徑影響細(xì)胞的增殖和生理活動。目前已人工合成數(shù)十種生長抑素類似物(sSA)，用得較多的為奧曲肽(Octreotide)和RC-160等幾種8肽SSA。其優(yōu)點是：較易合成、

9、Mr小(1000左右)、血中清除快、穿透力強、靶向性好以及在瘤內(nèi)保留時間長等。近年許多試驗證實，放射標(biāo)記生長抑素類似物可以顯著抑制許多表達(dá)SSTR腫瘤(神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌等)的生長，使腫瘤明顯縮小或消失。通過對實驗性癌瘤的抑瘤生長研究表明，療效較好，但其仍存在腫瘤對標(biāo)記配體攝取量很低的問題，尤對體積較大的移植瘤更加突出。本實驗旨在研究SSTR2在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2中，采用免疫組化方法和逆轉(zhuǎn)錄

10、-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TR-PCR)檢測其SSTR受體及其mRNA的表達(dá)情況。并用生長抑素類似物.奧曲肽進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)觀察用藥前后對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡及生長抑制作用的變化，利用配體與受體結(jié)合具有高特異性、高選擇性和高親和性的特點，采用放射性核素標(biāo)記的配體泡括激素、神經(jīng)遞質(zhì)及受體激動劑或阻斷劑等)作為顯像劑，可使之與高密度表達(dá)的腫瘤上相應(yīng)受體結(jié)合，而達(dá)到分子顯像的目的。同時，研究锝標(biāo)奧曲肽

11、作為腫瘤受體分子顯像劑診斷肝細(xì)胞肝癌的特異性、準(zhǔn)確性，并可根據(jù)本研究進(jìn)一步探討锝標(biāo)奧曲肽的顯像機理及其影響顯像質(zhì)量的分子生物學(xué)因素，從而為臨床提供更好的分子影像顯像劑，進(jìn)一步也可以為將來開展SSTR介導(dǎo)的分子靶向治療提供理論與現(xiàn)實基礎(chǔ)。
　　 目的：研究生長抑素受體在原發(fā)性肝癌(PLC)組織中的表達(dá)特性、荷人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠模型中受體分子顯像的攝取情況，為早期診斷肝細(xì)胞肝癌提供一種敏感度、特異度與準(zhǔn)確度都比較高的可進(jìn)行臨床

12、運用的分子顯像診斷方法。
　　 方法：⑴用RT-PCR和免疫組化的方法了解生長抑素受體在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)；然后觀察奧曲肽(Octreotide)對肝癌細(xì)胞株的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡現(xiàn)象。⑵建立裸鼠的腫瘤模型，用锝標(biāo)奧曲肽經(jīng)SPECT顯像儀對荷瘤裸鼠及正常裸鼠進(jìn)行動態(tài)顯像及0.5h，1h，2h，3h，4h，4.5h，5h，6h，24h的延遲顯像。應(yīng)用感興趣區(qū)(ROI)技術(shù)勾畫裸鼠的肝臟、肺臟、心臟及大腦的放射性計數(shù)、腫瘤部位的放射性

13、計數(shù)(T)，同時獲得30分鐘內(nèi)各感興趣區(qū)的時間(T)-放射性(A)圖。⑶通過腫瘤組織對放射性核素锝(99mTc)的攝取情況，間接揭示腫瘤組織對放射標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)的攝取率，為放射標(biāo)記奧曲肽(Octreotide)用于原發(fā)性肝癌分子治療提供生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：①在生長抑素受體亞型在肝癌細(xì)胞株HepG2、QGY-7701和SMMC-7721中的表達(dá)不完全一致，但是它們所共同的是均為穩(wěn)定且高表達(dá)生長抑素受體亞型

14、1和亞型2(SSTR1、SSTR2)，并且均未發(fā)現(xiàn)SSTR3表達(dá)。由免疫組化亦證實SSTR1和SSTR2呈高表達(dá)。②99mTc-octreotide在正常裸鼠腎臟及肝臟內(nèi)分布較多，肺部及心臟部位放射性較低，頭部放射性分布最少，99mTc-octreotide主要通過泌尿系統(tǒng)排泄；頭部、肺部、心臟、肝臟部位30min內(nèi)放射性隨時間延遲逐漸下降。③注射99mTc-octreotide后3h～4h腫瘤顯像最清晰，檢查時間內(nèi)腫瘤部位放射性分布明