Tim-3對鼠源性巨噬細胞內TLR4-LPS信號通路的影響.pdf

1、目的：炎癥性腸病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其病因及發(fā)病機制目前尚不明確。Tim-3是2001年發(fā)現(xiàn)的TIM家族中的重要一員，有研究表明IBD中Tim-3表達異常。TLRs信號通路作為連接固有免疫及適應性免疫的橋梁，既是機體防御病原體入侵的重要門戶，又是炎癥反應的啟動閘門，大量文獻報道已確認TLRs信號通路異常在IBD發(fā)病中起重要作用。近年來有研究顯示Tim-3和TLR4信號通路在免疫相關疾病中可互為調控，但目前尚未見兩者在IBD中共同發(fā)揮作

2、用的報道。我們的前期研究顯示，實驗性結腸炎鼠模型中TLR4信號通路過度激活，用Tim-3單抗處理后可使腸粘膜中Tim-3表達上調，TLR4信號通路關鍵分子MyD88表達下調，提示Tim-3與TLR4均參與IBD的發(fā)生發(fā)展。本文旨在體外采用Tim-3過表達質粒轉染小鼠源性巨噬細胞RAW264.7，明確Tim-3對巨噬細胞中TLR4/LPS信號通路是否有影響，探討Tim-3及TLR4/LPS信號通路在IBD中的作用。
　　方法：①培養(yǎng)

3、小鼠巨噬細胞RAW264.7至對數(shù)生長期，給予不同濃度LPS分別作用6h、12h后收集細胞（重復3次）。②采用陽脂質體轉染技術將pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3轉染RAW264.7細胞，觀察有無熒光及熒光強度，并收集細胞檢測Tim-3的mRNA及蛋白表達水平(重復3次）。③Tim-3過表達對巨噬細胞內TLR4/LPS信號通路及促炎因子分泌的影響。實驗分組：未轉染組:未轉染的小鼠巨噬細胞RAW264.7。空質粒組:轉染空質粒

4、的小鼠巨噬細胞RAW264.7。Tim-3質粒組:轉染Tim-3質粒的小鼠巨噬細胞RAW264.7。上述各組再分為LPS作用與無LPS作用兩組，選擇LPS作用的最佳濃度和時間點(1ug/ml，6h)，6h后收集細胞及細胞培養(yǎng)上清（重復4次）。④檢測方法：實時熒光定量PCR方法檢測細胞內Tim-3、TLR4、MyD88 mRNA的表達；免疫印跡方法檢測細胞內Tim-3、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白的表達；固相多重雙抗夾心

5、ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量。
　　結果：⑴不同濃度LPS作用巨噬細胞6h，在0-1ug/ml濃度范圍內，巨噬細胞內TLR4、MyD88、Tim-3 mRNA表達隨LPS濃度升高而增加，其中1ug/ml LPS組顯著高于其他濃度組（P＜0.05）。作用12h，100ng/ml LPS組TLR4 mRNA的表達顯著高于其他濃度組(P＜0.05)，而各組間MyD88、Tim-3 mRNA表達無

6、顯著性差異（P＞0.05）。⑵LPS作用巨噬細胞不同時間，在0-1ug/ml濃度范圍內，6h組TLR4和MyD88 mRNA表達均高于12h組，其中1ug/ml LPS作用6h組顯著高于對應的12h組(P＜0.05)。此外，1ug/ml LPS作用6h組Tim-3 mRNA表達也顯著高于對應的12h組（P＜0.05）。⑶成功構建pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3重組表達質粒，酶切后電泳顯示兩條帶，其分子量大小與預期相一致。測

7、序分析顯示插入片段與PubMed基因文庫(GenBank Accession: AF450241.1)中的Tim-3基因序列相似性為100％。⑷Tim-3重組質粒轉染RAW264.7細胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光。細胞內Tim-3 mRNA及蛋白表達顯著高于未轉染組(P＜0.05)，提示轉染成功。⑸無論有無LPS作用，轉染Tim-3的巨噬細胞內Tim-3 mRNA及蛋白表達均顯著高于未轉染Tim-3組(P＜0.05，P＜0.01)。

8、同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05）。⑹在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞內TLR4 mRNA及蛋白表達均顯著高于未轉染Tim-3組(P＜0.05);而在無LPS作用組，轉染與未轉染組間無顯著性差異(P＞0.05)。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組TLR4 mRNA及蛋白的表達均顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05）。⑺在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞內My

9、D88蛋白表達顯著高于未轉染Tim-3組(P＜0.05);而在無LPS作用組，轉染與未轉染組間無顯著性差異(P＞0.05)。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組MyD88蛋白的表達均高于對應的無LPS作用組，其中未轉染組和轉染Tim-3組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。⑻在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞內pNF-κB p65蛋白表達顯著高于未轉染Tim-3組(P＜0.05);而在無LPS作用組，轉染與未轉染組間無顯著性差

10、異（P＞0.05）。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組pNF-κB p65蛋白的表達均顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05)。⑼在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量顯著高于未轉染Tim-3組（P＜0.05）;而在無LPS作用組，轉染Tim-3對TNF-α的含量無顯著影響（P＞0.05）。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組TNF-α的含量均顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05)。⑽

11、在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量顯著高于未轉染組(P＜0.01);而在無LPS作用組，轉染Tim-3對IL-6的含量無顯著影響（P＞0.05）。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組IL-6的含量均顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05，P＜0.01)。⑾在LPS作用組，轉染Tim-3的巨噬細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量高于未轉染Tim-3組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;在無LPS作用組，

12、轉染Tim-3對IFN-γ的含量無顯著影響（P＞0.05）。同時，無論有無轉染Tim-3，LPS作用組IFN-γ的含量均顯著高于對應的無LPS作用組(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結論：①LPS可激活小鼠巨噬細胞TLR4信號通路及上調Tim-3的表達，促進促炎因子分泌，且在一定范圍內呈濃度依賴性。②在無其它因素作用下，Tim-3過表達對小鼠巨噬細胞TLR4信號通路及促炎因子分泌無明顯影響。③在LPS作用下，Tim-3過表達可