環(huán)境水源和臨床標(biāo)本軍團(tuán)菌檢測及酶切分型研究.pdf

1、軍團(tuán)菌(Legionella)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，在環(huán)境水源中分布甚廣，是引起人類軍團(tuán)菌病的重要病原體。目前已確認(rèn)軍團(tuán)菌有50多個種，70多個血清型，接近20個種有臨床分離報道，其中嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)與人類的疾病關(guān)系最為密切。自軍團(tuán)菌病暴發(fā)以來，已有許多成熟的方法應(yīng)用于軍團(tuán)菌檢測鑒定，但傳統(tǒng)的軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)法難度大、耗時長；血清學(xué)分型只能用于已知菌種的檢測；生化表型鑒定分辨率低，重復(fù)性差；其它方法

2、如可溶性蛋白電泳、脂肪酸成分分析等，也均存在不足。因此，極需一種快速有效的檢測鑒定方法。近年來，與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的酶切分型方法已廣泛應(yīng)用于微生物的檢測鑒定，該技術(shù)通過對特異性基因片段進(jìn)行酶切，不僅能與PCR的高靈敏度相結(jié)合，而且能為軍團(tuán)菌鑒定提供更為客觀、可靠及高效的結(jié)果。本論文通過對環(huán)境水源和臨床痰液標(biāo)本進(jìn)行軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)、16S rRNA PCR、酶切分型鑒定，再用16S rRNA基因測序分析法對酶切分型結(jié)果進(jìn)行考證，結(jié)果如下

3、：
　　 為了建立聚合酶鏈反應(yīng)-酶切分型快速鑒定軍團(tuán)菌方法，探討廣州地區(qū)環(huán)境水源軍團(tuán)菌的分布狀況。本研究于2008年11月～2009年1月在廣州市珠江琶洲段、黃埔村珠江支流和池塘、黃埔古港、白云山水庫、天河公園和華南植物園內(nèi)湖泊，采集水樣44份環(huán)境水樣，用本室改良BCYEα-DGVPC軍團(tuán)菌培養(yǎng)基作培養(yǎng)，對分離菌株同時采用生化反應(yīng)、16SrRNA PCR、酶切分型及16S rRNA基因測序鑒定。結(jié)果顯示：在廣州地區(qū)初分離的115

4、株軍團(tuán)菌可疑菌株，經(jīng)生化反應(yīng)和16S rRNA PCR鑒定其中112株為軍團(tuán)菌菌株。再經(jīng)酶切分型和16S rRNA基因測序鑒定，檢出嗜肺軍團(tuán)菌66株，非嗜肺軍團(tuán)菌46株，其中菲氏軍團(tuán)菌20株，戈氏軍團(tuán)菌17株，橡樹嶺軍團(tuán)菌7株，長灘軍團(tuán)菌2株。比較兩種方法對嗜肺軍團(tuán)菌檢出率完全一致，說明酶切分型檢測嗜肺軍團(tuán)菌具有高度的敏感性和特異性。結(jié)果也同時表明，廣州地區(qū)環(huán)境水源軍團(tuán)菌陽性率約為59.1％，以嗜肺軍團(tuán)菌最多(58.9％)，且在同一環(huán)境

5、水源中存在多種軍團(tuán)菌。
　　 為了建立臨床痰液標(biāo)本軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，提高培養(yǎng)陽性率。本研究采集50份新鮮痰液標(biāo)本，分為兩組，一組直接預(yù)處理后進(jìn)行培養(yǎng)，另一組加入標(biāo)準(zhǔn)菌株后再預(yù)處理及培養(yǎng)。預(yù)處理先液化處理，然后分別采用直接接種、酸處理或熱處理后再接種軍團(tuán)菌選擇性BCYEa-DGVPC培養(yǎng)基，觀察菌落生長情況。根據(jù)軍團(tuán)菌生長緩慢及菌落形態(tài)和在缺乏L-半胱氨酸的平板、血平板上不生長的特點做初步判斷，生化反應(yīng)及PCR法進(jìn)行確證

6、。結(jié)果顯示：50份未加菌的痰液均未分離出軍團(tuán)菌；50份加有軍團(tuán)菌的模擬痰標(biāo)本直接接種的檢出率為58％，其中酸處理的標(biāo)本檢出率為70％，熱處理的標(biāo)本檢出率為66％。三種培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，單獨的熱處理與直接處理相比較并沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P值為0.261)，單獨的酸處理與直接處理相比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P值為0.003)，而酸處理和熱處理培養(yǎng)陽性結(jié)果比較并不具有一致性。說明酸處理和熱處理兩種方法均可以提高軍團(tuán)菌檢出率。其中酸處理可以顯著提高軍團(tuán)菌