一起軍團(tuán)菌爆發(fā)事件的流行病學(xué)調(diào)查及軍團(tuán)菌TaqMan探針PCR檢測技術(shù)的建立.pdf

1、軍團(tuán)菌病首發(fā)于1976年的美國一次軍人聚會，1978年國際上正式將該病原體命名為嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)。由軍團(tuán)菌引起的以肺炎為主要表現(xiàn)的急性傳染病稱為軍團(tuán)菌病。重癥病例病程進(jìn)展快，病死率高，在公共衛(wèi)生上意義重大，日益受到人們的關(guān)注。我院于2010年2、3月間成功處理一起某訓(xùn)練基地的反季節(jié)流行、臨床罕見的軍團(tuán)菌病爆發(fā)事件。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查，認(rèn)為該事件為在冬季陰冷氣候下，因太陽能熱水器儲水罐污染血清1型嗜肺

2、軍團(tuán)菌(Lp1)導(dǎo)致，其中住院病例34例，由于救治及時，實(shí)現(xiàn)了零死亡率。本研究分兩部分，第一部分針對該事件進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查；第二部分建立了一種可同時區(qū)分軍團(tuán)菌屬和嗜肺軍團(tuán)菌的TaqMan探針PCR檢測技術(shù)。
　　第一部分一起軍團(tuán)菌爆發(fā)事件的流行病學(xué)調(diào)查
　　目的：我院成功診治一批反季節(jié)流行的軍團(tuán)菌肺炎患者，就該爆發(fā)事件的疫情特點(diǎn)及血清流行病學(xué)方面展開研究，以期能夠?yàn)檐妶F(tuán)菌病的流行病學(xué)研究提供一些有益的線索。
　　方法：

3、
　　1對該單位所有患者及接觸者進(jìn)行了現(xiàn)場回顧性流行病學(xué)調(diào)查。
　　2采集患者急性期及恢復(fù)期血清、本單位在崗人員血清、及自然人群血清，用酶聯(lián)免疫法查IgM抗體，陽性者用微量凝集法對抗原成分進(jìn)行進(jìn)一步檢測。
　　3了解該單位供水情況，采集該單位多點(diǎn)環(huán)境水樣，進(jìn)行分離培養(yǎng)。
　　4整理住院患者臨床病歷資料。
　　5應(yīng)用流行病學(xué)方法，對上述資料進(jìn)行整理分析。
　　結(jié)果：
　　1本單位在崗人員中軍團(tuán)菌血

4、清IgM抗體陽性率較自然人群有顯著差異。經(jīng)微量凝集法檢測，認(rèn)為本次流行為Lp1感染所致。
　　2從太陽能熱水器儲水罐流出口水樣、淋浴噴頭水樣中均分離出Lp1，活菌計數(shù)為100 to150 CFU/mL，與患者血清抗體檢測結(jié)果相符，其余水樣均為陰性。本單位2周內(nèi)于浴室淋浴人群與未淋浴人群發(fā)病率差異十分顯著，P=0.002，故本次爆發(fā)可能與淋浴氣溶膠傳播有關(guān)。
　　334例住院患者均表現(xiàn)為發(fā)熱，多可見畏寒、咳嗽、胸悶胸痛、納差、

5、腹痛等癥狀，部分伴有乏力、頭痛、肌痛等。一般實(shí)驗(yàn)室檢查不典型。肺部病變多跨葉侵犯，形成小斑片狀散發(fā)的多形性滲出性病變。患者癥狀改善明顯早于影像學(xué)改變。
　　4治療上對首批患者分組實(shí)驗(yàn)性治療，發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星療效好，隨后發(fā)病的所有患者均給予左氧氟沙星治療，部分患者加用阿奇霉素或利福平，所有患者預(yù)后良好。對可疑人群中體溫達(dá)到37℃者，積極給予預(yù)防性治療，有效減少了發(fā)病率。
　　結(jié)論：
　　1本次反季節(jié)流行的軍團(tuán)菌病事件，經(jīng)流

6、行病學(xué)調(diào)查，認(rèn)為可能與太陽能儲水罐污染Lp1，通過浴室氣溶膠傳播有關(guān)。未發(fā)現(xiàn)人-人傳播。
　　2軍團(tuán)菌病臨床癥狀及一般實(shí)驗(yàn)室檢查不典型，易誤診?；颊甙Y狀改善明顯早于影像學(xué)改變。
　　3軍團(tuán)菌可以使正常身強(qiáng)體壯的人患病，如干預(yù)及時，抗生素應(yīng)用得當(dāng)，預(yù)后良好，甚至可不出現(xiàn)臨床癥狀。
　　第二部分軍團(tuán)菌TaqMan探針PCR檢測技術(shù)的建立
　　目的：建立一種特異、快速、敏感的，能同時檢測軍團(tuán)菌屬和嗜肺軍團(tuán)菌的TaqMa

7、n探針熒光定量PCR方法，并用于檢測臨床和環(huán)境樣品。
　　方法：利用軍團(tuán)菌屬特異性23S rRNA基因和嗜肺軍團(tuán)菌種特異性mip基因的特異性序列設(shè)計引物和TaqMan探針，兩條探針5'端均標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記TAMRA。提取Lp1標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，擴(kuò)增出DNA目的片段，構(gòu)建含有目的基因序列的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。優(yōu)化了熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并對軍團(tuán)菌、嗜肺軍團(tuán)菌、非嗜肺軍團(tuán)菌及其它細(xì)菌進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性、敏感

8、性、重復(fù)性。選取部分環(huán)境及臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1根據(jù)軍團(tuán)菌屬23SrRNA基因和嗜肺軍團(tuán)菌mip基因的保守序列，設(shè)計出特異性引物和TaqMan探針，構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC-Lp-23S和pUC-Lp-mip，建立了一種軍團(tuán)菌熒光定量PCR檢測方法。
　　2該方法檢測靈敏度達(dá)10copies/反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載量，優(yōu)于普通PCR檢測，具有高度特異性、重復(fù)穩(wěn)定性。從菌株核酸的提取至檢測完成僅需2h左右。
　

9、　3對35份環(huán)境水樣進(jìn)行了檢測，檢出3株嗜肺軍團(tuán)菌和3株非嗜肺軍團(tuán)菌。經(jīng)重復(fù)測定仍為相同結(jié)果。所有水樣經(jīng)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和普通PCR法檢測均顯示為陰性。對不同稀釋度模擬痰樣檢測，菌量為102CFU/ml及以上濃度的模擬痰樣均可檢出。對臨床80份隨機(jī)痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測，2份23SrRNA基因檢測及mip基因檢測均陽性，而其余標(biāo)本均陰性。
　　結(jié)論：本文建立的TaqMan探針熒光定量PCR是一種可同時區(qū)分嗜肺與非嗜肺軍團(tuán)菌屬的特異、敏感的