人肝癌細(xì)胞Hep G2中HPV18E6和E7基因的整合.pdf

1、【背景】：
　　人類(lèi)乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是持續(xù)嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題。高危型HPV已被公認(rèn)是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的最重要因素之一。除了宮頸癌，在食管癌、喉癌、卵巢腫瘤、乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌中也檢測(cè)到HPV病毒基因存在。但是HPV在肝癌中的感染情況卻很少有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　【材料與方法】：
　　(1)HPV18在HepG2細(xì)胞的整合鑒定。首先用免疫組織化學(xué)(IHC)Anti-Hepatocyte抗體鑒定HepG2為肝細(xì)胞

2、。然后PCR擴(kuò)增HPV18E6E7基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后測(cè)序鑒定。熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)整合的原位信號(hào)，而Alu-PCR鑒定HPVE6E7整合的基因毗鄰位點(diǎn)。
　　(2)整合的HPV18E6E7對(duì)HepG2細(xì)胞致癌機(jī)理及其信號(hào)通路。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和免疫印跡(Westernblot)分別檢測(cè)E6和E7轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)。RNAi和基因芯片(RealTimePCRArray)來(lái)研究下調(diào)癌基因E7對(duì)肝癌細(xì)

3、胞HepG2的增殖和凋亡的影響及可能的信號(hào)通路。針對(duì)HPV18E7基因編碼區(qū)，設(shè)計(jì)并合成3對(duì)靶向的siRNA寡核苷酸(HPV18E7-63、HPV18E7-74和HPV18E7-112)。應(yīng)用熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)來(lái)檢測(cè)序列的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化后，siRNA寡核苷酸經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后E6和E7轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。EdU染色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)

4、胞的增殖和凋亡情況。構(gòu)建pGPHI/GFP/Neo-shRNA載體并篩選單克隆細(xì)胞群。人細(xì)胞周期和凋亡信號(hào)通路基因芯片檢測(cè)下調(diào)E7后增殖和凋亡相關(guān)基因的變化。
　　(3)HPV16/18在臨床肝癌標(biāo)本的感染情況。原位雜交檢測(cè)肝癌組織芯片的HPV16/18的陽(yáng)性率。
　　【結(jié)果】：
　　(1)HPV18E6E7引物在預(yù)期位置(847bp)擴(kuò)增出目的條帶，測(cè)序結(jié)果與GenBank中HPV18(X05015)比對(duì)匹配率達(dá)99

5、％。IHC表明HepG2細(xì)胞為肝細(xì)胞。FISH表明HepG2細(xì)胞中期和間期都有HPV18的原位雜交信號(hào)出現(xiàn)。
　　(2)RT-PCR和Westernblot證實(shí)HPV18E7在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都有表達(dá)，而E6在轉(zhuǎn)錄水平有表達(dá)但蛋白水平表達(dá)較弱。熒光FAM-siRNA證實(shí)了轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%。在三對(duì)siRNA序列中，HPV18E7-63和HPV18E7-112被證實(shí)有效。EdU染色法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組E7-siRNA轉(zhuǎn)染48h，60h和

6、72h后S期細(xì)胞分別為9.39%±3.55%,17.29%±5.85%和30.87%±4.26%，而對(duì)照組NC-siRNA分別為18.74%±6.66%,24.03%±5.35%和41.97%±8.73%(p＜0.05)。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞組24h、48h和72h細(xì)胞的總凋亡率分別為7.26%±0.29%,22.03%±0.23%和19.20%±0.78%，與對(duì)照組細(xì)胞的總凋亡率5.25%±0.7

7、6%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。RealTimePCRArray篩查出了相關(guān)基因的改變包括CyclinH,UBA1,E2F4,p53,p107,FASLG,NOL3和CASP14等。
　　(3)原位雜交篩查肝癌芯片標(biāo)本為9%(9/100)的標(biāo)本感染HPV16/18。
　　【結(jié)論】：
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)HPVE6和E7基因能整合到人肝癌細(xì)胞HepG2中并且表達(dá)E6和E7癌蛋白。RNAi能抑制E6和E7的表達(dá)，抑