基于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象對(duì)益氣活血方抗大鼠肝纖維化療效及分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景:肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是指肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)(Extraeellularmatrix，ECM)尤其是膠原的過量沉積。它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是各種病因所致的慢性肝病的共同病理過程，是發(fā)展到肝硬化必經(jīng)階段，并與肝癌有關(guān)。因此抗纖維化治療對(duì)肝硬化及肝癌的防治、延緩疾病進(jìn)程、減少患者痛苦及疾病支出具有重要臨床意義。近年來的研究表明:肝星狀細(xì)胞活化、肝竇毛細(xì)血管化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均參與了肝纖維化的進(jìn)程，其中對(duì)上皮間

2、質(zhì)轉(zhuǎn)化參與肝纖維化的研究相對(duì)較少，所以進(jìn)一步研究影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一病理生理現(xiàn)象的調(diào)控因素，可為肝纖維化的治療提供新的途徑。目前西醫(yī)尚無特別有效的抗肝纖維化藥物，而中醫(yī)藥在防治肝纖維化方面進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，顯示出較好的療效和優(yōu)勢(shì)。益氣活血方（黃芪、莪術(shù)、九香蟲、桃仁）是孫桂芝教授在總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提煉出來的治療肝纖維化肝硬化的小驗(yàn)方。經(jīng)本人導(dǎo)師呂文良主任和廣安門醫(yī)院肝炎門診的其他專家大量臨床觀察驗(yàn)證，益氣活血方的確有顯

3、著的抗肝纖維化療效。
　　 目的:通過觀察益氣活血方對(duì)大鼠肝纖維化的影響，研究其抗肝纖維化的療效;驗(yàn)證肝纖維化進(jìn)程中存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)現(xiàn)象且轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βⅡ型受體（Transforming growth factor-β receptorⅡ，TGFβRⅡ）/Sma

4、ds信號(hào)通路參與了EMT，為EMT參與HF提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù);探討益氣活血方抗肝纖維化的分子機(jī)制，以便更好的運(yùn)用于臨床，也為挖掘傳承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵提供新的研究思路。
　　 方法:采用四氯化碳和乙醇復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化模型，從第5周起，造模的同時(shí)開始給予藥物干預(yù)，藥物干預(yù)12周后采取大鼠血清、肝臟、脾臟。檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspar

5、tate aminotransferase，AST）、白蛋白(Albumin，ALB)含量。記錄肝臟、脾臟重量并計(jì)算肝指數(shù)、脾指數(shù)。取各組大鼠肝臟的相同部位進(jìn)行病理切片HE染色，光鏡下觀察各組大鼠病理結(jié)果，并進(jìn)行纖維化分級(jí)。免疫組化法檢測(cè)肝組織中E-鈣粘素(Epithelial Ca2+dependent cell adhesion molecules，E-cadherin)、TGF-β1、TGFβ RⅡ、Smad2，并應(yīng)用Axio V

6、ision Release4.8.2圖像分析軟件測(cè)量各指標(biāo)的陽性表達(dá)面積總值和陽性面積百分比。
　　 結(jié)果:經(jīng)四氯化碳和乙醇造模后，模型組大鼠的肝濕重、脾濕重、肝指數(shù)、脾指數(shù)均升高，與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);給予益氣活血方治療后大鼠的肝濕重、脾濕重、肝指數(shù)、脾指數(shù)下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組ALT、AST升高，ALB降低，與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);給予益氣

7、活血方治療后大鼠的ALT、AST水平降低，ALB升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠肝臟纖維化程度全部處于S0期，模型組主要集中在S4期，二者的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);益氣活血組主要分布在S1-S3期，與模型組的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，TGF-β1、TGFβ RⅡ、Smad2的表達(dá)上調(diào)，與空白

8、對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);益氣活血組E-cadherin表達(dá)較模型組提高，TGF-β1、TGFβRⅡ、Smad2的表達(dá)較模型組降低，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:益氣活血方能降低肝纖維化大鼠肝濕重、脾濕重、肝指數(shù)、脾指數(shù)，并能降低ALT、AST，提高ALB水平，從而改善肝纖維化大鼠肝脾形態(tài)及肝功能。從病理上來看，益氣活血方能改善肝臟炎癥程度，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，促使肝纖維化逆轉(zhuǎn)，具有很好

9、的抗肝纖維化療效。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與了大鼠肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程，模型組E-cadherin表達(dá)的下降是其參與纖維化的證據(jù)。益氣活血方能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，提示其可以逆轉(zhuǎn)EMT，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。益氣活血方能通過下調(diào)TGF-β1、TGFβ RⅡ、Smad2的表達(dá)阻斷TGF-β/TGFβ RⅡ/Smads通路，從而阻斷肝纖維化進(jìn)程。鑒于TGF-β/TGFβRⅡ/Smads通路是EMT的主要通路之一，而我們的研究發(fā)現(xiàn)益氣活血方既可以逆