益氣活血方調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞自噬及逆轉(zhuǎn)肝纖維化機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡的結(jié)果。盡管肝纖維化的發(fā)生機(jī)制的闡明已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但仍然缺乏有效的抗肝纖維化策略。然而中藥在抗肝纖維化治療中具有多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合作用，我們的自擬益氣活血方是由黃芪、丹參、云苓、郁金、白豆蔻等中藥組成，具有“益氣活血，疏肝健脾”之功效，有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可抑制細(xì)胞過度自噬從而發(fā)揮對(duì)受損細(xì)胞的保護(hù)作用。自噬（autophagy）是一些有缺陷的細(xì)胞器

2、和未折疊蛋白被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用從而維持細(xì)胞內(nèi)平衡的代謝過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬能通過降解脂滴為肝星狀細(xì)胞活化提供能量，并影響肝星狀細(xì)胞的增殖及膠原纖維的產(chǎn)生，但自噬在肝纖維化中的作用以及益氣活血方對(duì)自噬的調(diào)控作用及分子機(jī)制尚不清楚。本研究以CCl4誘導(dǎo)Wistar大鼠肝纖維化模型，以扶正化瘀復(fù)方為陽性對(duì)照，應(yīng)用益氣活血方進(jìn)行治療研究，明確益氣活血方能否有效逆轉(zhuǎn)/延緩肝纖維化進(jìn)展，并進(jìn)一步探明

3、肝臟細(xì)胞自噬與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及益氣活血方是否可通過肝臟細(xì)胞自噬阻止肝纖維化進(jìn)展，為肝纖維化的防治提供新的策略及科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　選用健康雄性Wistar大鼠，并隨機(jī)分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，模型組：采用30％四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）腹腔注射建立肝纖維化模型；益氣活血方干預(yù)組：CCl4腹腔注射聯(lián)合益氣活血沖劑灌胃；扶正化瘀方干預(yù)組：CCl4腹腔注射聯(lián)合扶正化瘀復(fù)方灌胃；對(duì)

4、照組：等體積橄欖油代替CCl4及等體積的生理鹽水代替益氣活血沖劑灌胃，均喂養(yǎng)8周，水合氯醛麻醉下處死動(dòng)物，留取血清標(biāo)本；肝組織部分采用4%中性甲醛溶液固定，備行肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)分析，其余肝組織液氮快速冷凍后儲(chǔ)存于-80℃冰箱，以備蛋白及mRNA檢測。
　　1.實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況：觀察大鼠活動(dòng)力、毛發(fā)、進(jìn)食及存活情況。
　　2.血清生化學(xué)變化：采用全自動(dòng)生化分析儀、酶法測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminot

5、ransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。
　　3.肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察：4%中性甲醛溶液固定肝組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋，行5μm組織切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色及Masson三色染色觀察肝臟炎癥及纖維化程度；采用免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-S

6、MA）和I型膠原α1鏈（alpha-1 type I collagen，Col1A1）的表達(dá)，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（200×），測定α-SMA及Col1A1表達(dá)的累積光密度（integrated optical density，IOD）。
　　4.肝臟細(xì)胞自噬及纖維化相關(guān)基因表達(dá)檢測：采用-80oC冰箱儲(chǔ)存肝組織標(biāo)本，分別提取蛋白和RNA，實(shí)時(shí)定量PCR及Weste

7、rn blot檢測肝纖維化相關(guān)基因α-SMA和Col1A1的表達(dá)及自噬相關(guān)因子自噬蛋白7（Autophagy-related gene7， Atg7）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3, LC3）及泛素結(jié)合蛋白（SQSTM1/p62）的表達(dá)。采用Image J分析系統(tǒng)軟件分析Western blot電泳條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

8、：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間比較均采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)驗(yàn)動(dòng)物一般情況：對(duì)照組大鼠全部存活，精神飽滿，活潑好動(dòng)，毛發(fā)有光澤，攝食、飲水正常；模型組大鼠存活6只，精神萎靡，活動(dòng)遲緩無力，毛發(fā)無光澤，攝食及飲水均明顯減少，造模過程中6只動(dòng)物死亡；益氣活血及扶正化瘀中藥干預(yù)組分別有6只大鼠存活

9、，精神可，活動(dòng)自如，毛發(fā)略有光澤，攝食、飲水可，二組各有3只動(dòng)物死亡。
　　2.ALT、AST檢測：分別檢測對(duì)照組、CCl4肝纖維化模型組、益氣活血方干預(yù)組和扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平，結(jié)果顯示CCl4肝纖維化模型組大鼠血清ALT、AST水平較對(duì)照組顯著升高，依次為106.80±18.24 vs38.17±4.99，278.40±66.14 vs121.00±11.87，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；益氣活

10、血方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組顯著降低，依次為66.80±10.42，122.60±16.65，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組大鼠血清ALT、AST水平較CCl4肝纖維化模型組也有所改善，依次為73.20±10.33，125.4±16.92，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　3.肝組織病理學(xué)變化：對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)均正常，肝索排列整齊，肝板以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列

11、；CCl4肝纖維化模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死及竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成（S5.64±0.22，vs對(duì)照組，P<0.01）；益氣活血方干預(yù)組肝纖維化程度較CCl4肝纖維化模型組明顯減輕（S3.70±0.35，vs模型組， P<0.01）；扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組肝組織纖維化程度亦較模型組好轉(zhuǎn)（S3.9±0.34，vs模型組，P<0.01）。
　　4.肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3B和

12、p62 mRNA表達(dá)：CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達(dá)較對(duì)照組均顯著上調(diào)，p62下降，依次為0.88±0.13 vs0.19±0.07，0.99±0.075 vs0.05±0.024，1.11±0.12 vs0.33±0.07，0.92±0.072 vs0.32±0.02，1.16±0.17 vs3.18±0.18，P<0.001；與CCl4肝纖維化模型組相比，益氣活血方干預(yù)組肝

13、組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達(dá)明顯降低，p62上升依次為0.34±0.05，0.32±0.09，0.66±0.08，0.66±0.07，1.79±0.09，P<0.01；扶正化瘀干預(yù)組肝組織與CCl4肝纖維化模型組相比α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3B mRNA表達(dá)明顯降低，p62略上升依次為0.48±0.043，0.31±0.11，0.74±0.07，0.58±0.03，1.45±0.03，P

14、<0.05。
　　5.肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7、LC3BII和p62蛋白表達(dá)：CCl4肝纖維化模型組大鼠肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值較對(duì)照組均顯著增加，為34675.09±1200.29 vs10360.13±1442.25，22480.85±1035.92 vs2915.58±574.99，P<0.001；與CCl4肝纖維化模型組相比，益氣活血方干預(yù)組肝組織α-SMA和 Col1A1累積光密度值均明

15、顯下降，分別為22051.47±1610.70、12565.8±932.23，P<0.001；扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組與CCl4肝纖維化模型組相比肝組織α-SMA和Col1A1累積光密度值亦明顯下降，分別為22556.52±1510.60、12997.9±903.85，P<0.001；CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著增強(qiáng)，依次為0.83±0.05 vs0.05±0.006，

16、0.73±0.002 vs0.29±0.02，0.12±0.002 vs0.06±0.002，0.83±0.024 vs0.53±0.02，P<0.001；益氣活血方干預(yù)組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)明顯降低，依次為0.19±0.02，0.35±0.003，0.10±0.002，0.67±0.02，P<0.001；扶正化瘀復(fù)方干預(yù)組肝組織α-SMA、Col1A1、Atg7和LC3BII蛋白表達(dá)也明顯降低

17、，依次為0.31±0.02，0.47±0.003，0.10±0.003，0.62±0.03，P<0.001；CCl4肝纖維化模型組小鼠肝組織p62蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著降低，為0.26±0.02 vs0.68±0.03，P<0.001；益氣活血方和扶正化瘀方干預(yù)組肝組織p62蛋白表達(dá)均明顯改善，分別為0.45±0.02，0.35±0.04，P<0.001。
　　結(jié)論：
　　1.肝臟細(xì)胞自噬可能為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一