hTERT啟動(dòng)子靶向性活體光學(xué)實(shí)時(shí)成像技術(shù)在腫瘤診斷及療效評(píng)估中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的:
　　 惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重疾病之一。惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷是患者預(yù)后的重要決定因素。在過去的幾十年中,醫(yī)學(xué)成像設(shè)備的發(fā)展使腫瘤診斷得到質(zhì)的提高,如超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像等普遍而有效的檢查設(shè)備。但這些檢查方法并不能從本質(zhì)上區(qū)分病變的良惡性,而且對(duì)一些小的病灶不易發(fā)現(xiàn)。正電子發(fā)射斷層掃描是目前鑒別占位性病變良惡性的最佳方法,但PET有時(shí)對(duì)炎性占位和惡性腫瘤不易辨別。近年來新發(fā)展起來的腫瘤特異

2、性成像技術(shù),能夠借助腫瘤標(biāo)記物從根本上區(qū)分惡性腫瘤和正常組織。腫瘤特異性顯像技術(shù)是指利用惡性腫瘤的標(biāo)記物作為靶向元件,定向?qū)雸?bào)告基因如熒光蛋白或熒光素酶,使其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性的表達(dá),采用高敏的體外檢測(cè)設(shè)備捕獲瘤內(nèi)報(bào)告基因發(fā)出的熒光信號(hào),從而對(duì)腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)無創(chuàng)的監(jiān)測(cè)。
　　 端粒酶是一種核糖核蛋白酶。人端粒酶主要由端粒酶RNA、端粒相關(guān)蛋白1和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶組成。近年來的研究表明,hTERT是

3、端粒酶復(fù)合物中的限速成分,與端粒酶一樣,它在絕大多數(shù)腫瘤中表達(dá),而在正常體細(xì)胞中少有表達(dá)。hTERT的這種腫瘤特異性表達(dá)的特性,使其成為近年來最受歡迎的廣譜腫瘤特異性標(biāo)記物,在腫瘤靶向的診斷及治療中受到越來越廣泛的應(yīng)用。由于hTERT的表達(dá)受hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控,基于hTERT的廣譜腫瘤特異性,hTERT啟動(dòng)子也為許多研究者用于腫瘤靶向性診斷及治療的研究。有研究表明,hTERT啟動(dòng)子的核心序列長約260bp,其中有含有一種E-box序

4、列,該序列可以和原癌基因c-myc家族編碼的一種螺旋-環(huán)-螺旋拉鏈基元蛋白因子結(jié)合而上調(diào)hTERT的表達(dá)。
　　 小動(dòng)物無創(chuàng)活體顯像平臺(tái)是由高敏感CCD攝像探頭檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出的微弱熒光信號(hào)。報(bào)告基因如GFP或luciferase在體內(nèi)發(fā)射出的熒光信號(hào)極弱,而且當(dāng)其透射出體外時(shí)往往伴有動(dòng)物皮毛或糞便的自發(fā)熒光的干擾。
　　 基于以上分析,本研究采用hTERT啟動(dòng)子作為腫瘤靶向性元件,為提高其在腫瘤細(xì)胞中的活性,降低其在正

5、常體細(xì)胞中的活性,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其序列進(jìn)行優(yōu)化改建。在改建后的hTERT啟動(dòng)子下游加載GFP報(bào)告基因,由可整合的慢病毒轉(zhuǎn)移至裸鼠的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá),采用激光共聚焦或小動(dòng)物熒光成像系統(tǒng),體內(nèi)外研究基于hTERT啟動(dòng)子的慢病毒對(duì)惡性腫瘤的靶向性成像能力。在此基礎(chǔ)之上,將hTERT啟動(dòng)子下游加載治療基因胞嘧啶脫氨酶和報(bào)告基因GFP同時(shí)表達(dá),將其構(gòu)建成hTERT啟動(dòng)子靶向的治療慢病毒,并通過激光共聚焦或小動(dòng)物熒光成像系統(tǒng),體內(nèi)外實(shí)時(shí)無創(chuàng)性研究基于

6、hTERT啟動(dòng)子的治療性慢病毒對(duì)惡性腫瘤的靶向殺傷作用。為基于hTERT啟動(dòng)子的活體光學(xué)實(shí)時(shí)成像技術(shù)在腫瘤診斷及治療效應(yīng)評(píng)估中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1.hTERT啟動(dòng)子設(shè)計(jì)及功能檢測(cè):根據(jù)文獻(xiàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成hTERT啟動(dòng)子,將其克隆到標(biāo)準(zhǔn)的啟動(dòng)子功能檢測(cè)系統(tǒng)pGL3-basic質(zhì)粒中,同時(shí)構(gòu)建含CMV、SV40或野生型hTERT啟動(dòng)子的對(duì)照組。采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定啟動(dòng)子在端粒酶陽性或陰性的腫瘤細(xì)胞

7、以及原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的活性,以確定優(yōu)化型hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子的端粒酶靶向性。
　　 2.基于hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子腫瘤靶向性活體光學(xué)成像在腫瘤診斷中作用的研究:采用第三代慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒作為骨架質(zhì)粒,將GFP報(bào)告基因克隆至其多克隆位點(diǎn),構(gòu)建CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的慢病毒載體;將hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子替代CMV啟動(dòng)子,構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的慢病毒載體。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒,采用熒光定量PCR檢測(cè)病毒

8、滴度。體外實(shí)驗(yàn):將上述兩種慢病毒分別體外感染端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞或端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,采用激光共聚焦觀察GFP的表達(dá);體內(nèi)試驗(yàn):構(gòu)建皮下生長端粒酶陽性或陰性的荷瘤裸鼠模型,并將上述兩種病毒分別瘤內(nèi)注射,采用活體成像系統(tǒng)觀察上述兩種慢病毒對(duì)腫瘤的靶向性顯像,進(jìn)一步采用組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)GFP蛋白的表達(dá)。
　　 3.基于hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子腫瘤靶向性活體光學(xué)成像在腫瘤治療效應(yīng)實(shí)時(shí)無創(chuàng)評(píng)估中作用的研究:

9、以pLenti-hTERTp-GFP作為骨架質(zhì)粒,在優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子下游克隆CD自殺基因,以pLenti-hTERTp-GFP作為陰性對(duì)照。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒,采用熒光定量PCR檢測(cè)病毒滴度。體外實(shí)驗(yàn):將上述慢病毒體外感染端粒酶陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞,并檢測(cè)GFP和CD的表達(dá);在感染了病毒的細(xì)胞內(nèi)加入CD前藥5-FC,并采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率,以確定該治療型病毒在體外對(duì)細(xì)胞是否產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。體內(nèi)試驗(yàn):構(gòu)建端粒酶陽性

10、和端粒酶陰性皮下荷瘤裸鼠模型,將上述兩種慢病毒分別瘤內(nèi)注射,感染后一周給裸鼠腹腔注射前藥5-FC,在活體成像儀下觀察病毒對(duì)腫瘤生長的抑制過程以及整體動(dòng)物水平下腫瘤生長的特點(diǎn),全程測(cè)量并記錄腫瘤體積的變化;進(jìn)一步組織學(xué)檢測(cè)腫瘤CD蛋白的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子能夠在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)熒光素酶,且其表達(dá)水平與CMV、SV40啟動(dòng)

11、子接近,略高于野生型hTERT啟動(dòng)子;而在端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)熒光素酶。提示該優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子具有在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)下游基因的能力,由于端粒酶在85％以上的惡性腫瘤中表達(dá),因此,hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子可以作為腫瘤靶向元件用于腫瘤活體熒光成像。
　　 2.酶切及測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了含有hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒及CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的對(duì)照質(zhì)粒。病毒包裝后檢測(cè)其滴度達(dá)

12、108數(shù)量。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-GFP慢病毒能夠在端粒酶陽性腫瘤的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP,而在端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞以及原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)GFP,而pLenti-CMVp-GFP慢病毒在端粒酶陽性及端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)GFP,提示pLenti-hTERTp-GFP慢病毒具有明顯的端粒酶靶向性。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),pLenti-hTERTp-GFP慢病毒感染24小時(shí)后,采用活體光學(xué)成像系統(tǒng)在端粒酶陽性的荷瘤鼠中就能

13、觀察到瘤內(nèi)熒光,并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)30天,熒光范圍和強(qiáng)度隨腫瘤的生長而擴(kuò)大增強(qiáng),能夠?qū)崟r(shí)反應(yīng)腫瘤的位置和大小以及有無轉(zhuǎn)移,而在端粒酶陰性的荷瘤鼠中則未見明顯熒光;對(duì)照慢病毒pLenti-CMVp-GFP感染后,在端粒酶陽性及端粒酶陰性荷瘤鼠中均可見熒光表達(dá)。組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-GFP慢病毒感染后,只在端粒酶陽性的腫瘤內(nèi)有GFP蛋白的表達(dá),而端粒酶陰性腫瘤內(nèi)未見GFP蛋白表達(dá);而對(duì)照慢病毒pLenti-CMVp-GFP

14、感染后,在端粒酶陽性及端粒酶陰性腫瘤內(nèi)均可見GFP蛋白表達(dá)。
　　 3.酶切及測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了含有hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CD和GFP的慢病毒質(zhì)粒,以pLenti-hTERTp-GFP慢病毒作為空白對(duì)照。包裝病毒后檢測(cè)其滴度均達(dá)108數(shù)量級(jí)。體外研究發(fā)現(xiàn)pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染細(xì)胞后,采用RT-PCR和Western blot技術(shù)在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到CD和GFP表達(dá),而在端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)

15、未檢測(cè)到CD和GFP的表達(dá):體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)表明,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染細(xì)胞后能夠?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著殺傷效應(yīng)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)在端粒酶陽性的荷瘤鼠模型中,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射后,腫瘤生長速度明顯慢于pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤,而在端粒酶陰性腫瘤中,無論哪一種慢病毒瘤體內(nèi)注射,均不會(huì)影響腫瘤的生長;進(jìn)一步組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在端粒酶陽性腫瘤中,p

16、Lellti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤,其CD和GFP均有表達(dá),而pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤體內(nèi)注射的腫瘤僅有GFP蛋白表達(dá),在端粒酶陰性的腫瘤中,無論哪一種慢病毒瘤體內(nèi)注射,均未見CD和/或GFP的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.優(yōu)化后的hTERT啟動(dòng)子具有很好的腫瘤靶向性?？梢宰鳛閺V譜腫瘤靶向元件,應(yīng)用于腫瘤的靶向顯像及靶向治療。
　　 2.含有優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)

17、GFP的慢病毒在體外和體內(nèi)均能感染腫瘤細(xì)胞,并在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)GFP。結(jié)合小動(dòng)物活體成像平臺(tái),該病毒能夠?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤進(jìn)行無創(chuàng)的實(shí)時(shí)熒光成像,為腫瘤的早期特異性診斷和在體生物學(xué)行為研究提供依據(jù)。
　　 3.含有優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CD和GFP的慢病毒能夠在體外和體內(nèi)感染腫瘤細(xì)胞,并在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)CD和GFP。在體外感染端粒酶陽性細(xì)胞后能對(duì)其產(chǎn)生顯著的殺傷效應(yīng)。瘤體內(nèi)注射后,能長期持續(xù)抑制端粒

18、酶陽性腫瘤的生長,結(jié)合活體熒光成像系統(tǒng),可以實(shí)時(shí)無創(chuàng)地觀察到自殺基因在腫瘤內(nèi)表達(dá)的范圍和強(qiáng)度,以及對(duì)腫瘤生長抑制的全部過程。
　　 以上研究顯示將hTERT啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化改建后,在第三代慢病毒的攜帶下能夠在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)報(bào)告基因或(和)治療基因,結(jié)合小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng),能夠在動(dòng)物整體水平對(duì)在體腫瘤進(jìn)行靶向性實(shí)時(shí)無創(chuàng)成像,為腫瘤的靶向性診斷及治療效果的實(shí)時(shí)無創(chuàng)評(píng)估提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于端粒酶在85％以上的惡