FK506-SLN水凝膠的制備及其體外透皮和藥效學研究.pdf

1、研究背景:
　　 他克莫司(FK506)是一種大環(huán)內脂類免疫抑制劑，其作用機制與環(huán)孢素A相似，但是分子量更小，更容易滲透進入皮膚。其軟膏劑治療皮膚疾病主要通過阻斷鈣調神經磷酸酶活化而抑制皮損處T細胞的活化，另外，也可通過調節(jié)其它免疫細胞相關因子的釋放而改善皮損處的炎癥反應。這種抗炎活性與外用糖皮質激素相似，但是，外用他克莫司不具有糖皮質激素那樣的副作用。因此，深受皮膚科醫(yī)師的青睞。然而，由于他克莫司軟膏存在一定的系統(tǒng)暴露（系統(tǒng)吸

2、收），長期外用他克莫司有引起潛在系統(tǒng)副作用的可能，甚至存在潛在的致癌作用。由于缺乏長期安全性資料的比較，長期使用他克莫司長期使用的安全性問題倍受關注。為此，美國FDA要求外用他克莫司在包裝上加黑框警告，這是FDA關于藥物副作用最嚴厲的警告。
　　 研發(fā)低毒、低副作用的新藥可以緩解藥物的安全性問題。但是，越來越多的研究表明，只靠研發(fā)新藥是遠遠不夠的。原因之一是很多新藥在體外具有較理想的理化特性，然而，一旦真正應用到體內，則由于新藥

3、所處的理化環(huán)境改變，導致其在體內不能很好的發(fā)揮作用。因此，藥物新劑型的發(fā)展成為近幾年研究的熱點。固體脂質納米粒(SLN)是繼乳劑、脂質體、微粒和毫微粒之后，發(fā)展起來的一種新型藥物載體系統(tǒng)。它以生理相容性好的可降解的天然或合成無毒類脂為藥物載體材料，制成粒徑約在50～1000nm的亞微粒給藥系統(tǒng)，具有控制藥物釋放、避免藥物降解、毒性低、靶向性好、易于轉化為大規(guī)模生產等優(yōu)點。
　　 目前，SLN制備方法眾多，有高壓乳均法、微乳法、溶

4、劑擴散法、乳化蒸發(fā)法、膜接觸器法等。通過各種工藝處理手段，還可以將固體脂質納米粒制備成粉針劑、片制、丸劑、膠囊劑、凝膠劑等，以滿足對不同給藥方式的需求。SLN局部皮膚給藥具有許多優(yōu)點:1.“閉合膜作用”，其增進水合，提高藥物對皮膚的穿透率，還能夠修補皮膚因炎癥或損傷而導致破損的脂膜。2.緩釋性，可在表皮形成藥物貯存庫，緩慢而持久地釋放藥物;大量SLN在表皮內滯留，使真正進入真皮層藥物減少，從而避免了藥物全身吸收帶來的不良反應。3.無毒性

5、，制備SLN的脂質為生理相容性材料，安全無毒，對皮膚的刺激性小。
　　 關于他克莫司脂質體的研究還很少，目前處于起步階段。在國外，chougule等通過薄膜蒸發(fā)及高壓乳均技術制備了他克莫司脂質體凍干粉。其他克莫司脂質體粒徑為140nm，包封率為96％，zeta電位為1.017mV;他克莫司脂質體凍干粉體外藥物持續(xù)釋放達18小時。在國內，王啟平等采用乳化-溶劑揮發(fā)技術，用甲氧基聚乙二醇聚乳酸聚合物(PEG-PLA)制備了他克莫司微

6、球，其平均粒徑為545nm，平均載藥量為18.9％，平均包封率為25％，35天的藥物累積釋放率為67.21％。在前期的實驗中，我們采用改良的溶劑乳化擴散法，也已成功制備他克莫司固體脂質納米粒(FK506-SLN)，其平均粒徑為134nm，zeta電位為-25.2±10.3mV，包封率為88.74％，透射電子顯微鏡顯示FK506-SLN圓形，大小均勻，無明顯聚集現(xiàn)象。藥物體外釋放試驗顯示他克莫司自FK506-SLN釋放緩慢持續(xù)，藥物釋放控

7、釋性良好。但是，作為局部皮膚外用制劑，其真正的透皮情況是否與此一致？
　　 他克莫司固體脂質納米粒為混懸液，其保濕性及黏附性差，不便于皮膚外用。作為一種外用劑型，將SLN混懸液包封入軟膏或凝膠成為必然的選擇。水凝膠(hydrogel)是以水分為分散介質的凝膠，是一種良好的局部皮膚給藥劑型。很多研究采用卡波姆作水凝膠基質?？ú肥潜┧峋酆衔?，易溶于水形成酸性膠體，無毒無刺激性，與皮膚有良好的耦合性。
　　 隨著小鼠皮炎模

8、形發(fā)展成熟，將外用制劑用于小鼠模型，從而可以方便地評價外用藥物的療效。
　　 研究目的:
　　 以卡波姆-940為基質材料制備FK506-SLN水凝膠，以溫度試驗、含藥量及藥物滲漏率為評價指標考察所制備的水凝膠的理化性質。然后，通過體外透皮擴散試驗儀（Franz擴散池），以離體大鼠腹部皮膚為透皮擴散屏障進行體外透皮擴散實驗，以市售他克莫司軟膏為對照組，比較FK506-SLN水凝膠和市售他克莫司軟膏的透皮速度、累積透皮量Q

9、和皮膚內滯留量，初步考察FK506-SLN水凝膠的藥動學性質。之后，建立小鼠耳廓皮炎模型，分別以生理鹽水、市售他克莫司軟膏、FK506-SLN水凝膠治療，通過觀察皮損病理變化及高倍視野下(HPF)單一核細胞數(shù)目，初步考察FK506-SLN水凝膠的藥效學。
　　 方法:
　　 1.采用堿法，以卡波姆-940為凝膠材料、甘油為潤濕劑、三乙醇胺為中和劑，制備FK506-SLN水凝膠。
　　 2.以適量蒸餾水稀釋水凝膠，

10、磷鎢酸染色后通過電鏡觀察FK506-SLN水凝膠中納米粒的形態(tài)。
　　 3.肉眼評估FK506-SLN水凝膠的外觀性狀;以HPLC法檢測藥物含量，計算藥物的回收率、精密度;通過溫度試驗，以藥物含量及滲漏率為評價指標考察所制備的水凝膠的穩(wěn)定性。
　　 4.制備離體大鼠腹部皮膚，并考察離體皮膚對FK506測量的影響。
　　 5.通過體外透皮擴散試驗儀，以離體大鼠腹部皮膚為透皮擴散屏障進行體外透皮擴散實驗，以市售他克莫

11、司軟膏為對照組，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h間隔取樣，采用HPLC法測定樣品中FK506含量，通過比較FK506-SLN水凝膠和市售他克莫司軟膏的透皮速度、累積透皮量Q和皮膚內藥物滯留量，初步考察FK506-SLN水凝膠的藥動學性質。
　　 6.采用耳腫脹法，建立小鼠耳廓皮炎模型，以生理鹽水為對照，通過肉眼觀察皮損狀況、小鼠搔抓行為及皮損病理切片評估造模情況。
　　 7.建立小鼠耳廓皮炎模型，將模

12、型小鼠隨機分為三組，分別以生理鹽水、市售他克莫司軟膏、FK506-SLN水凝膠治療5天，以痊愈、好轉、無效為評價指標初步評估三種制劑的療效;通過觀察比較三組小鼠皮損病理變化及高倍視野單一核細胞數(shù)目，考察FK506-SLN水凝膠的藥效學。
　　 8.將實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行比較分析，48小時透皮試驗后所得數(shù)據(jù)及皮內藥物滯留實驗所得數(shù)據(jù)采用完全隨機設計資料的方差分析(One-wayANOVA)，重復觀察所得數(shù)據(jù)

13、采用重復測量數(shù)據(jù)的兩因素多水平分析法(ANOVA)，三組隨機設計的資料采用完全隨機設計資料的方差分析(One-wayANOVA)，當P＜0.05差異具有顯著性。
　　 結果
　　 1.采用堿法，成功制備FK506-SLN水凝膠，其為淡藍色半透明的半固體狀制劑，外觀均勻、細膩，易涂展、無油膩感。
　　 2.當流動相為乙腈-水-磷酸的體積比為70∶30:1、檢測波長在220nm、進樣量為20μl、流速為1.0ml/m

14、in、柱溫為50℃時，采用反相HPLC法測定FK506-SLN水凝膠的藥物含量，方法簡便可行。
　　 3.以外觀性狀、滲漏率及藥物含量為指標評價FK506-SLN水凝膠的穩(wěn)定性簡便可靠，當FK506-SLN水凝膠在低溫(4℃)的環(huán)境中放置30天，外觀、滲漏率及藥物含量均無明顯變化;而置于室溫(25℃)和高溫(40℃)條件下，則穩(wěn)定性較差。因此，F(xiàn)K506-SLN水凝膠適合于低溫(4℃)條件下密封保存。
　　 4.選用含3

15、0％乙醇的生理鹽水作為FK506-SLN水凝膠的透皮接收液，能較客觀地反應FK506的透皮情況。
　　 5.結合使用研缽及超聲細胞破碎儀制備透皮后皮膚乳糜液。以乙醇用為破乳劑破壞透皮后的FK506-SLN，促進藥物從透皮液內的脂質體中完全釋放出來，方法可行。
　　 6.體外透皮擴散試驗顯示，F(xiàn)K506-SLN水凝膠累積透過率及皮膚內藥物滯留量大于市售他克莫司軟膏，表明固體脂質納米粒能顯著增加藥物的角質層透過量及藥物在皮膚

16、內的滯留。
　　 7.采用二硝基氟苯(DNFB)免疫攻擊小鼠的方法，建立了小鼠耳廓皮炎模型，該建模方法簡便，易于操作;且可通小鼠搔抓行為及小鼠耳廓皮損病理變化等指標評估造模情況。經病理證實，該模型可以部分反應人類特應性皮炎的病理變化。
　　 8.小鼠耳廓皮炎模型治療實驗表明，F(xiàn)K506-SLN水凝膠在改善模型小鼠耳廓皮損炎癥方面的效果優(yōu)于市售他克莫司軟膏。
　　 結論:
　　 1.以卡波姆940為基質制備