磷酸化突觸素Ⅰ及其相關(guān)激酶在微波輻射致氨基酸遞質(zhì)釋放異常中的作用研究.pdf

1、目的和意義:近年來，隨著微波技術(shù)的廣泛應(yīng)用，針對微波輻射的生物效應(yīng)及有效防護(hù)的研究已迫在眉睫。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是微波輻射最為敏感的靶器官之一，微波輻射可引起學(xué)習(xí)記憶能力下降等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其機(jī)制仍有待研究。學(xué)習(xí)和記憶屬于腦的高級功能或高級神經(jīng)活動(dòng)，突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。突觸可塑性的實(shí)質(zhì)是突觸連接結(jié)構(gòu)和突觸傳遞效能的可塑性，其中突觸間信號傳遞通過神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來實(shí)現(xiàn)。突觸素Ⅰ與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的突觸結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)，且磷酸化的

2、突觸素Ⅰ調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放，啟動(dòng)突觸前的囊泡胞吐，從而完成遞質(zhì)傳遞過程。微波輻射后神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常是學(xué)習(xí)記憶功能障礙的重要原因之一，但其機(jī)制尚不明確。 因此本研究以突觸素Ⅰ為靶點(diǎn)，對微波輻射致突觸結(jié)構(gòu)損傷及突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常的機(jī)制進(jìn)行深入探討，為微波致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:(1)30mW/cm2微波輻射Wistar大鼠，輻射時(shí)間為5min。于輻射后6h，1d，3d，7d，14d及28d

3、，采用Morris水迷宮檢測其學(xué)習(xí)和記憶能力;通過HE染色觀察海馬組織結(jié)構(gòu);用Timm染色觀察海馬苔蘚纖維出芽生長;以免疫熒光檢測海馬原位突觸素Ⅰ表達(dá);用高效液相色譜法檢測突觸體氨基酸遞質(zhì)釋放量。以免疫電鏡及免疫印跡法檢測海馬不同位點(diǎn)的磷酸化突觸素Ⅰ及囊泡遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的定位及表達(dá)。(2)30mW/cm2微波輻射經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞，輻射時(shí)間為5min。于輻射后1h，6h，12h，1d，2d及3d，采用高效液相色譜法檢測氨基酸遞質(zhì)釋放

4、量;以免疫熒光及免疫印跡法檢測不同位點(diǎn)的磷酸化突觸素Ⅰ蛋白表達(dá);進(jìn)一步采用RNAi沉默突觸素Ⅰ或給予磷酸化突觸素Ⅰ上游激酶抑制劑進(jìn)行干預(yù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)微波輻射后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力及海馬結(jié)構(gòu)改變。①學(xué)習(xí)和記憶能力:30mW/cm2輻射后1d、2d、3d及7d，與假輻射組相比，平均逃避潛伏期明顯延長(p＜0.05或p＜0.01)。②海馬結(jié)構(gòu):30mW/cm2組部分神經(jīng)元固縮深染，尤以齒狀回顆粒細(xì)胞和CA3區(qū)錐體細(xì)胞損傷較重;

5、血管周圍間隙增寬。輻射后6h～7d，30mW/cm2組損傷程度呈逐漸加重趨勢;輻射后14d，損傷仍存在，但有所恢復(fù);輻射后28d，損傷基本恢復(fù)正常。③海馬苔蘚纖維出芽:學(xué)習(xí)和記憶后可見海馬苔蘚纖維由齒狀回向門區(qū)內(nèi)出芽生長，微波輻射后(即水迷宮后)7d和14d，30mW/cm2組苔蘚纖維出芽生長較假輻射組明顯減弱(p＜0.01);28d苔蘚纖維出芽生長減弱程度稍恢復(fù)(p＜0.05)。(2)微波輻射后大鼠海馬突觸素Ⅰ、磷酸化突觸素Ⅰ及氨基酸

6、遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)改變。①突觸素Ⅰ的原位表達(dá)改變:突觸素Ⅰ在海馬CA3區(qū)和齒狀回神經(jīng)元軸突及軸突末端表達(dá)豐富;與假輻射組相比，30mW/cm2輻射后6h-3d，突觸素Ⅰ表達(dá)明顯減弱，3d最為顯著;輻射后7-14d呈恢復(fù)趨勢;輻射后28d恢復(fù)正常。②突觸素Ⅰ與磷酸化突觸素Ⅰ表達(dá):30mW/cm2輻射后海馬突觸素Ⅰ表達(dá)于輻射后1d明顯增加(p＜0.01)、3d顯著減少(p＜0.01);30mW/cm2輻射后海馬ser-62/67位點(diǎn)的磷酸化

7、突觸素Ⅰ于1d和3d顯著增加（p＜0.05或p＜0.01），7d后基本恢復(fù)正常;ser-553位點(diǎn)的磷酸化突觸素Ⅰ表達(dá)于輻射后3d明顯減少(p＜0.01)，7d和14d明顯增加(p＜0.01);ser-603位點(diǎn)的磷酸化突觸素Ⅰ表達(dá)未見明顯異常。③VGAT和VGLUT1表達(dá):VGAT表達(dá)于輻射后6h、1d和7d明顯增加(p＜0.01)，VGLUT1于輻射后6h和1d表達(dá)明顯減少(p＜0.05或p＜0.01)，于輻射后7d和14d表達(dá)明顯

8、增加(p＜0.01)。④磷酸化突觸素Ⅰ、VGAT及VGLUT1原位表達(dá):輻射后7d，突觸前小亮型囊泡大量堆積，其中VGAT和磷酸化突觸素Ⅰ(ser-553)同時(shí)富集于堆積的囊泡中，而谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT1和磷酸化突觸素Ⅰ（ser-62/67）在其中未見明顯富集。(3)微波輻射后大鼠海馬Cdk5、Calpain和p35/25蛋白表達(dá)改變。Cdk5于輻射后6h、3d和7d明顯增加，輻射后14d明顯減少（p＜0.05或p＜0.01），Cal

9、pain于輻射后3d表達(dá)明顯增加(p＜0.01)，14d表達(dá)明顯減少(p＜0.05); p25于輻射后1d表達(dá)明顯減少(p＜0.05)，3d和7d表達(dá)明顯增加(p＜0.01); p35表達(dá)未見明顯異常。(4)微波輻射后PC12細(xì)胞磷酸化突觸素Ⅰ表達(dá)改變。磷酸化突觸素Ⅰ(ser-62/67)于輻射后6h表達(dá)明顯增加(p＜0.05);磷酸化突觸素Ⅰ(ser-553)于輻射后6h、12h表達(dá)明顯減少(p＜0.01)，48h表達(dá)明顯增加(p＜0

10、.01)。(5)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對PC12細(xì)胞中突觸素Ⅰ及磷酸化突觸素Ⅰ蛋白表達(dá)的影響。轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒GV175沉默突觸素Ⅰ，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒后突觸素Ⅰ及磷酸化突觸素Ⅰ（ser-62/67、ser-553）蛋白表達(dá)均明顯減少(p＜0.01)。(6)U0126及Roscovitine對微波輻射后PC12細(xì)胞磷酸化突觸素Ⅰ(ser-62/67、ser-553)及其相關(guān)激酶表達(dá)的影響。單純微波輻射后p-ERK及ser-62/67位點(diǎn)

11、突觸素Ⅰ磷酸化表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.05)，給予U0126后二者表達(dá)減少(p＜0.01)，輻射并給予抑制劑后二者表達(dá)明顯減少(p＜0.01);單純微波輻射后Cdk5表達(dá)增強(qiáng)(p＜0.05)，給予Roscovitine后Cdk5表達(dá)減少(p＜0.01)，照射并給予抑制劑與單純照射后相比明顯減少(p＜0.01)。ser-553位點(diǎn)突觸素Ⅰ磷酸化在單純微波輻射后減少(p＜0.01)，給予Roscovitine后表達(dá)增加(p＜0.05)，輻射并給予

12、抑制劑后表達(dá)亦增加(p＜0.01)。(7)微波輻射后氨基酸遞質(zhì)釋放量改變。①大鼠海馬突觸體氨基酸遞質(zhì)釋放:與假輻射組相比，30mW/cm2組γ-氨基丁酸釋放顯著減少(p＜0.01)。②PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放:30mW/cm2微波輻射后GABA及GLY釋放明顯減少(p＜0.01)。③轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒GV175對微波輻射后PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放的影響:轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒后GABA和GLY釋放減少(p＜0.01)，而輻射并轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒協(xié)同作用后

13、，與單純轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組、微波輻射組及單純轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組相比，GABA釋放明顯減少(p＜0.01)。④U0126及Roscovitine對微波輻射后PC12細(xì)胞氨基酸遞質(zhì)釋放的影響。單純給予U0126或Roscovitine后GABA和GLY釋放減少(p＜0.01)，而輻射并給予Roscovitine后與單純輻射相比GABA釋放明顯增加(p＜0.05)，輻射并給予U0126后與單純輻射相比氨基酸釋放未見明顯差異。
　　結(jié)論:30mW

14、/cm2微波輻射后:
　　1、大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降;海馬齒狀回及CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，苔蘚纖維出芽明顯受抑制，突觸素Ⅰ表達(dá)明顯減少;表明微波輻射可能通過抑制海馬突觸素Ⅰ的表達(dá)，引發(fā)突觸結(jié)構(gòu)損傷（表現(xiàn)為苔蘚纖維出芽生長抑制），最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　2、微波輻射后GABA釋放障礙，VGAT表達(dá)增加，表明輻射后囊泡攝取GABA增加，運(yùn)載有GABA的囊泡與突觸前膜錨定和胞吐過程存在異常;微波輻射后早期VGLUT1表

15、達(dá)減少，后期表達(dá)增加，提示微波輻射后早期囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，后期轉(zhuǎn)運(yùn)活躍，但對其釋放均無明顯影響。
　　3、微波輻射后p-ERK依賴的磷酸化突觸素Ⅰ（ser-62/67）表達(dá)增加，p-ERK活性增加;微波輻射后p-ERK正向調(diào)控ser-62/67位點(diǎn)突觸素Ⅰ的磷酸化。
　　4、微波輻射后Cdk5依賴的磷酸化突觸素Ⅰ（ser-553）表達(dá)減少;Cdk5、激活因子p25及其水解酶Calpain的表達(dá)增加;VGAT和ser-553