阿爾茨海默病腦內(nèi)老年斑形成及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分 BACE-1在AD病腦組織中的表達(dá)
　　 目的：觀察BACE-1在正常及阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)時(shí)的空間表達(dá)模式。
　　 方法：收集AD或癡呆病史超過(guò)3年的病人17例，非癡呆病人14例，不同年齡(22-34歲)恒河猴7只。首先運(yùn)用尼氏染色、bielschowsky銀染、免疫組織化學(xué)及western blot等方法對(duì)所收集材料進(jìn)行病理診斷及分組。進(jìn)而對(duì)各組腦進(jìn)行β-位點(diǎn)APP剪

2、切酶-1(β-siteAPP cleavage enzyme-1，BACE-1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察BACE-1在正常和異常腦內(nèi)的空間表達(dá)模式。
　　 結(jié)果：尼氏染色結(jié)果顯示為結(jié)構(gòu)清晰的人腦組織，老年斑和p-Tau同時(shí)存在者為AD實(shí)驗(yàn)組，二者均不存在者為非AD對(duì)照組。按以上標(biāo)準(zhǔn)分別將恒河猴分為老年組及正常組。分組結(jié)果顯示AD實(shí)驗(yàn)組和非AD對(duì)照組分別有7例，恒河猴老年組3例，正常組4例。Western blot結(jié)果顯示，AD實(shí)驗(yàn)

3、組p-Tau、淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein，APP)、不同分子量BACE-1及其β位點(diǎn)剪切產(chǎn)物的蛋白表達(dá)相對(duì)于非AD對(duì)照組均有明顯增加；恒河猴老年組腦內(nèi)不同分子量BACE-1蛋白含量顯著高于正常組。BACE-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，非AD對(duì)照組及恒河猴正常組BACE-1的表達(dá)模式與正常小鼠相似，即最強(qiáng)表達(dá)在嗅球及海馬苔蘚纖維，腦皮質(zhì)內(nèi)則主要分布在神經(jīng)氈內(nèi)，表現(xiàn)為弱的類似背景染色。AD實(shí)驗(yàn)組及恒河猴

4、老年組腦內(nèi)BACE-1表達(dá)出現(xiàn)異常上調(diào)，表現(xiàn)為大小不一、形狀各異的斑塊樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 BACE-1的異常表達(dá)增加可能參與了AD及老年恒河猴腦內(nèi)淀粉斑的形成
　　 第二部分 BACE-1上調(diào)與Aβ沉積以及失營(yíng)養(yǎng)性軸突病變之間的關(guān)系
　　 目的：觀察AD病人及AD樣恒河猴腦內(nèi)BACE-1上調(diào)與Aβ沉積以及失營(yíng)養(yǎng)性軸突病變之間的關(guān)系，揭示AD時(shí)可能的老年斑形成過(guò)程。
　　 方法：對(duì)各組鄰片

5、進(jìn)行免疫組織化學(xué)DAB雙標(biāo)及免疫熒光雙標(biāo)觀察其腦內(nèi)BACE-1標(biāo)記的失營(yíng)養(yǎng)性神經(jīng)突起與β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)、APP、早老素(presenilin-1，PS1)等AD相關(guān)分子之間的時(shí)空關(guān)系。另通過(guò)BACE-1與突觸囊泡素(synaptophysin，SYN)及微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)的免疫雙標(biāo)確定失營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)突起的性質(zhì)。
　　 結(jié)果：AD實(shí)驗(yàn)

6、組免疫組織化學(xué)鄰片結(jié)果顯示腦內(nèi)斑塊少的樣本BACE-1、Aβ空間上完全匹配，而斑塊多的樣本Aβ表達(dá)量明顯高于BACE-1；恒河猴老年組免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示異常表達(dá)增加的BACE-1定位于失營(yíng)養(yǎng)性軸突末梢(BACE-1與SYN免疫共存)，且與APP(BACE-1剪切底物)、PS1(Ap在γ位點(diǎn)的剪切酶)、Aβ等AD相關(guān)分子有免疫共存。腫脹軸突內(nèi)表達(dá)上調(diào)的BACE-1與Aβ完全共存，軸突周圍沒(méi)有Aβ免疫陽(yáng)性產(chǎn)物存在。隨著腫脹軸突的進(jìn)一步芽生

7、長(zhǎng)大，一些體積小的BACE-1免疫陽(yáng)性神經(jīng)突起簇周圍可出現(xiàn)少量Aβ陽(yáng)性產(chǎn)物，并隨著神經(jīng)突起簇的體積增大而增多。當(dāng)BACE-1標(biāo)記的失營(yíng)養(yǎng)性神經(jīng)突起形成大的玫瑰花瓣樣結(jié)構(gòu)時(shí)，其周圍已有大量致密的Aβ陽(yáng)性產(chǎn)物存在。
　　 結(jié)論：
　　 1.AD時(shí)過(guò)量產(chǎn)生的Aβ最初可能來(lái)源于失營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)突起中的軸突成分；
　　 2.BACE-1可能參與調(diào)節(jié)失營(yíng)養(yǎng)性軸突產(chǎn)生過(guò)量Aβ。
　　 第三部分 BACE-1上調(diào)及淀粉斑形成的

8、實(shí)驗(yàn)性機(jī)制探討
　　 目的：探討神經(jīng)元功能降低對(duì)Tg2576小鼠腦內(nèi)BACE-1及老年斑形成的影響。
　　 方法：隨機(jī)獲取6月齡Tg2576小鼠28只，制備左側(cè)嗅覺(jué)功能剝奪模型以模擬AD時(shí)腦內(nèi)低代謝狀態(tài)，未剝奪側(cè)(右側(cè))嗅球作為自身對(duì)照，存活至7、8、9、12、18、24個(gè)月。運(yùn)用細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，CO)組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)、westernblot、ELISA等形態(tài)學(xué)、分子

9、生物學(xué)方法觀察功能剝奪對(duì)Tg2576小鼠嗅覺(jué)中樞內(nèi)BACE-1及淀粉斑形成的影響。
　　 結(jié)果：鄰片對(duì)比顯示單側(cè)嗅覺(jué)剝奪Tg2576小鼠嗅球及梨狀皮質(zhì)內(nèi)BACE-1與CO表達(dá)相反，嗅覺(jué)剝奪側(cè)相對(duì)于未剝奪側(cè)BACE-1表達(dá)增加，CO則表達(dá)下降，提示模型制備成功。Western blot、β位點(diǎn)APP剪切酶活性測(cè)定和Aβ40、Aβ42的ELISA測(cè)定結(jié)果顯示剝奪側(cè)BACE-1、β位點(diǎn)APP剪切酶C末端剪切產(chǎn)物、Aβ40、Aβ42表達(dá)

10、均高于未剝奪側(cè)。BACE-1及Aβ免疫組織化學(xué)染色鄰片對(duì)比顯示：隨著年齡的增長(zhǎng)Tg2576小鼠嗅球及梨狀皮質(zhì)內(nèi)老年斑形成逐漸增多，且斑塊最先出現(xiàn)在梨狀皮質(zhì)，然后累及嗅球。BACE-1與Aβ等免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示Tg2576小鼠嗅球及梨狀皮質(zhì)內(nèi)BACE-1表達(dá)在失營(yíng)養(yǎng)性軸突末梢(BACE-1與SYN免疫共存)，表達(dá)增加的BACE-1與Aβ免疫共存，斑塊形成過(guò)程類似于第二部分。
　　 結(jié)論：
　　 神經(jīng)元的代謝功能降低可能是