福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(TibialDyschondroplasia,TD)是肉雞常見的骨骼疾病之一，以骺板成熟面形成不能血管化亦不能礦化的軟骨栓為特點(diǎn)。TD的發(fā)生與品種、日糧的Ca/P比和陰陽離子的比例等因素有關(guān)，但TD的發(fā)病機(jī)理仍然不甚明了。目前，肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良、肉雞腹水綜合征和肉雞猝死綜合征是公認(rèn)的嚴(yán)重影響現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖業(yè)的三大營養(yǎng)代謝病，每年給世界肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，肉雞TD的發(fā)病機(jī)理和防治研究是目前世界上禽病

2、研究的熱點(diǎn)之一。 采用原位雜交、半定量RT-PCR等對肉雞TD發(fā)生的分子機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)肉雞患TD時(shí)，病變的軟骨細(xì)胞生長分化相關(guān)基因存在表達(dá)紊亂、表達(dá)水平降低或表達(dá)缺失的現(xiàn)象。雖然采用以上方法對TD的發(fā)生的分子機(jī)理作了一定的闡明，但這些方法存在一定的盲目性和局限性，有必要采用新的研究手段對肉雞TD發(fā)病的分子機(jī)理進(jìn)行深入探討，為抗TD肉雞品種選育，治療藥物分子設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。 為此，本研究采用福美雙誘發(fā)肉雞TD，觀察其動態(tài)

3、組織病理學(xué)變化特征，分析其與自然發(fā)生TD的異同。同時(shí)，采用抑制性消減雜交(suppressionsubstractivehybridization，SSH)篩選鑒定與肉雞TD相關(guān)的差異表達(dá)基因，并對差異基因表達(dá)的時(shí)序性進(jìn)行了初步研究，取得了以下結(jié)果： 1.福美雙對肉雞生長性能和脛骨軟骨發(fā)育不良的影響 飼料中添加福美雙可顯著提高肉雞TD發(fā)病率，達(dá)到94.44％。病理剖檢結(jié)果癥狀典型，與自然發(fā)生的TD癥狀相似，且表現(xiàn)更為突出

4、，脛骨干骺端粗大，脛骨彎曲：骺端生長板增厚，不鈣化、無血管的軟骨栓占據(jù)整個(gè)干骺端；而且與自然發(fā)病相比，還有福美雙誘發(fā)TD獨(dú)特的病理特征，即生長板質(zhì)地松軟，切面不完整，易斷層。肉雞生長受阻，體增重顯著下降，料重比增加，嚴(yán)重影響了肉雞生長性能。表明本研究成功建立了肉雞TD模型。 2.福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的動態(tài)組織病理學(xué)變化觀察 動態(tài)組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，福美雙可促進(jìn)軟骨細(xì)胞極劇增殖，影響正常的細(xì)胞分化，導(dǎo)致細(xì)胞大

5、量死亡，擠壓血管，血管壞死，基質(zhì)合成受阻，延緩軟骨鈣化，最終嚴(yán)重?cái)_亂軟骨成骨的調(diào)控機(jī)能；同時(shí)，將后期自然發(fā)生的TD和福美雙誘發(fā)TD進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)二者組織病理學(xué)變化極為相似，從而進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證福美雙成功誘發(fā)典型的肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良，為深入研究TD的發(fā)生發(fā)展，以及研究預(yù)防TD的藥物提供新的思路和重要線索。 3.福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良差異表達(dá)基因的篩選與鑒定 利用SSH技術(shù)構(gòu)建了肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良正反向差

6、減cDNA文庫。通過PCR和斑點(diǎn)雜交，從文庫中篩選出40個(gè)差異表達(dá)EST。對差異表達(dá)EST進(jìn)行序列分析，獲得10個(gè)差異表達(dá)基因。以半定量RT-PCR對其中的7個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，在TD發(fā)生中，X型膠原(ColX)、I型膠原a1(ColIa1)、熱休克蛋白(Hsp90)、NADH脫氫酶(NADHDH)等4個(gè)基因表達(dá)被上調(diào)；細(xì)胞色素c氧化酶Ⅲ(COXⅢ)、Matrilin-3(MATN3)、碳酸酐酶(CA2)等3個(gè)基因表

7、達(dá)被下調(diào)。ColX通過形成基質(zhì)小泡使鈣離子流入并區(qū)劃基質(zhì)成分來調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化；ColI脯氨酰的羥化作用是骨形成的關(guān)鍵；CA2參與骨骼的發(fā)育與重構(gòu)；Matrilin-3作為一種表面成分，通過與ColIX直接相連，或者以COMP為接頭間接地與ColIX相連，可與基質(zhì)大分子網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)并且調(diào)節(jié)纖維和纖維基質(zhì)間(蛋白聚糖)的相互作用，有助于骨化時(shí)基質(zhì)的成熟；Hsp90具有多種細(xì)胞功能，作為分子伴侶調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)象、參與蛋白組裝、參與生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制細(xì)

8、胞凋亡、延緩衰老、抗應(yīng)激等：NADHDH和COXⅢ參與細(xì)胞的電子傳遞，與細(xì)胞的能量代謝有關(guān)。對TD中干擾軟骨細(xì)胞分化的差異表達(dá)基因的鑒定，有助于TD分子機(jī)理的研究，從而為遺傳選育消除機(jī)能紊亂開辟了新的途徑。 4.福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良基因差異表達(dá)的時(shí)序性研究 用SSH技術(shù)所篩選的上調(diào)表達(dá)基因X型膠原(ColX)、I型膠原(ColI)、熱休克蛋白(Hsp90)和下調(diào)表達(dá)基因Chondromodulin-1(ChM-