2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一類(lèi)具有多種生物活性的功能性糖蛋白,在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的血管生成、基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化和功能活性調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。本文旨在克隆、表達(dá)雞VEGF基因,并在獲得其活性蛋白的基礎(chǔ)上,觀(guān)察它對(duì)福美雙誘發(fā)的肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(TD)、肝腎抗氧化功能、血液生化指標(biāo)以及軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響,為闡明禽類(lèi)TD的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)和重要啟示。
   試驗(yàn)Ⅰ.雞VEGF(chV

2、EGF)基因的原核表達(dá)、純化及抗體制備
   根據(jù)GenBank收錄的雞VEGF序列(AY168004)設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR方法從雞脛骨生長(zhǎng)板總RNA中擴(kuò)增得到VEGF基因,并將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體。測(cè)序鑒定正確后,將chVEGF片段亞克隆至帶有組氨酸標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-32a(+)。再將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-chVEGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),實(shí)現(xiàn)chVEGF

3、的有效表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明,得到的原核表達(dá)產(chǎn)物是大小約為38kD的融合蛋白。Western blotting分析顯示,表達(dá)的chVEGF蛋白能夠與組氨酸抗體和山羊抗人VEGF多克隆抗體結(jié)合,具有良好的免疫反應(yīng)性。通過(guò)鎳離子親和層析純化原核表達(dá)的融合蛋白,以純化蛋白免疫家兔制備多克隆抗體,ELISA結(jié)果顯示該抗體效價(jià)達(dá)到1∶10240。
   試驗(yàn)Ⅱ.雞VEGF(chVEGF)在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性鑒定
  

4、 設(shè)計(jì)一對(duì)引物,在兩引物的5'端分別插入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn),從保存的重組質(zhì)粒載體pMD18-T-VEGF上亞克隆得到雞VEGF基因片段,該片段長(zhǎng)576bp,編碼192個(gè)氨基酸殘基。將其亞克隆至酵母表達(dá)載體pPICZα-A,重組陽(yáng)性質(zhì)粒以電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株,用Zeocin平板篩選重組子。將PCR鑒定的高拷貝菌株用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h,菌液離心取上清,用SDS-PAGE和Western blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)

5、行分析。結(jié)果顯示,雞VEGF在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)物有兩種,其相對(duì)分子量分別為約46 kD和70 kD,兩者均可被山羊抗人VEGF抗體和先期制備的雞VEGF抗體識(shí)別,具備良好的抗原活性。經(jīng)過(guò)初步處理的酵母表達(dá)VEGF蛋白作用于雞胚絨毛尿囊膜,能夠明顯刺激其血管的生成,具有生物學(xué)活性。
   試驗(yàn)Ⅲ.福美雙誘發(fā)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良模型的建立及其機(jī)理
   120羽1日齡AA肉仔雞預(yù)飼一周后隨機(jī)分為4組,從8日齡起分別給予

6、基礎(chǔ)日糧(對(duì)照組),福美雙日糧(基礎(chǔ)日糧+福美雙100 mg·kg-1),福美雙低銅日糧(基礎(chǔ)日糧+福美雙100 mg·kg-1+CuSO4·5H2O50 mg·kg-1),福美雙高銅日糧(基礎(chǔ)日糧+福美雙100 mg·kg-1+CuSO4·5H2O100 mg·kg-1),試驗(yàn)期至21日齡。結(jié)果表明:(1)福美雙能夠誘發(fā)21日齡肉雞典型的TD,顯著增加TD發(fā)生率及嚴(yán)重程度,降低肉雞生長(zhǎng)速度和脛骨長(zhǎng)度,提高血清Ca、P、ALP、SGOT

7、的水平,與對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05),但對(duì)血清SGPT水平和脛骨重并無(wú)明顯影響;日糧中添加銅能抑制福美雙對(duì)肉雞TD和生產(chǎn)性能的影響,兩者之間存在明顯的互作關(guān)系;(2)福美雙提高了肉雞肝、心臟、胰腺中的銅水平,降低了腎組織中的銅含量,福美雙日糧組與對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05);在肉雞日糧中添加銅能降低福美雙引起的肝銅水平增加,提高腎銅的含量,福美雙低銅、高銅日糧組與福美雙日糧組相比,差異顯著(P<0.05)。(3)福美雙

8、誘導(dǎo)的肉雞TD生長(zhǎng)板上,血管通道稀少或閉塞,內(nèi)皮細(xì)胞和損傷中心的軟骨細(xì)胞大量死亡,增值區(qū)軟骨細(xì)胞排列紊亂,柱狀結(jié)構(gòu)消失,未完全肥大的過(guò)渡性軟骨細(xì)胞大量積聚形成異常軟骨。結(jié)論:福美雙是一種有效的TD誘導(dǎo)劑,可用于建立TD模型;損傷肉雞肝、腎功能,影響Ca、P代謝和銅在機(jī)體不同組織的分布利用以及阻止血管形成和侵入生長(zhǎng)板可能是福美雙誘導(dǎo)TD發(fā)生的重要作用途徑之一。
   試驗(yàn)Ⅳ.雞VEGF酵母表達(dá)產(chǎn)物對(duì)肉雞TD、肝腎抗氧化功能和血液相

9、關(guān)生化指標(biāo)的影響
   240羽1日齡AA肉仔雞在預(yù)飼一周后隨機(jī)分為8組,每組30羽。A組為基礎(chǔ)日糧對(duì)照組,E組為福美雙日糧對(duì)照組,B、C、D組為基礎(chǔ)日糧試驗(yàn)組,F(xiàn)、G、H組為福美雙日糧試驗(yàn)組。在基礎(chǔ)日糧中短期(8至14日齡)添加福美雙(100 mg·kg-1)誘導(dǎo)TD發(fā)生。從9日齡起,A、E兩組外的肉雞均通過(guò)腿部肌肉注射分別給予3個(gè)不同劑量(10μg·kg-1、30μg·kg-1、50μg·kg-1)的酵母表達(dá)雞VEGF蛋白,

10、每4日一次,試驗(yàn)至21日齡。結(jié)果表明:(1)短期添加福美雙顯著增加了肉雞TD的發(fā)生率和TD指數(shù),明顯提高各日齡肉雞血清中P、ALP、StrACP的水平,顯著降低15日齡肉雞血清Ca的水平但明顯提高21日齡肉雞血清中Ca的水平(P<0.05);(2)重組VEGF蛋白顯著提高15日齡各試驗(yàn)組肉雞血清Ca、P、ALP和StrACP的水平,與各自對(duì)照組相比,均差異顯著(P<0.05);明顯降低21日齡福美雙組肉雞血清Ca、P、StrACP水平但

11、顯著提高血清Ca水平,各試驗(yàn)組與福美雙對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05);(3)重組VEGF蛋白對(duì)肉雞的生長(zhǎng)速度和TD發(fā)生率無(wú)明顯影響,但顯著降低福美雙誘發(fā)的TD損傷嚴(yán)重程度,各福美雙試驗(yàn)組與其對(duì)照組相比,均差異顯著(P<0.05);(4)注射中、低劑量的雞VEGF蛋白顯著提高肉雞肝、腎組織中T-AOC、SOD、GSH-Px的水平,各試驗(yàn)組與其對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05);高劑量的VEGF重組蛋白會(huì)損傷肉雞肝和腎的抗氧化能力。

12、結(jié)論:修復(fù)肝腎損傷增強(qiáng)其抗氧化能力,影響礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的代謝,間接或直接調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化相關(guān)細(xì)胞的功能,可能是VEGF在禽類(lèi)TD病理發(fā)生過(guò)程中的重要作用之一。
   試驗(yàn)Ⅴ.雞VEGF酵母表達(dá)產(chǎn)物在TD損傷形成和修復(fù)期對(duì)軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響
   試驗(yàn)動(dòng)物的分組、飼養(yǎng)同試驗(yàn)Ⅳ。為研究雞VEGF酵母表達(dá)產(chǎn)物在TD損傷形成和修復(fù)期對(duì)軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響,在肉雞15、21日齡時(shí)每組分別取5羽斷頸處死

13、后采集脛骨近端生長(zhǎng)板,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)生長(zhǎng)板軟骨中Bcl-2、X型膠原、MMP-13、Runx2 mRNA水平的變化。結(jié)果顯示:(1)短期添加福美雙顯著上調(diào)TD損傷形成期肉雞脛骨生長(zhǎng)板上編碼Bcl-2、X型膠原基因的表達(dá),顯著下調(diào)MMP-13、Runx2基因的表達(dá)(P<0.05);在TD損傷修復(fù)期,顯著下調(diào)Bcl-2、X型膠原和Runx2基因的表達(dá)(P<0.05),但對(duì)MMP-13基因的表達(dá)沒(méi)有影響;(2)重組雞VEGF蛋白在

14、TD損傷形成期顯著上調(diào)生長(zhǎng)板軟骨中MMP-13、Runx2基因的表達(dá)(P<0.05),只在低劑量時(shí)上調(diào)Bcl-2和X膠原基因的表達(dá);在TD損傷修復(fù)期,該重組蛋白則顯著上調(diào)脛骨生長(zhǎng)板上X型膠原、MMP-13、Runx2基因的表達(dá),同時(shí)以劑量依賴(lài)性的方式下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)。結(jié)論:MMP-13、Runx2可能在TD病理發(fā)生中具有重要作用;外源VEGF蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨關(guān)鍵基因的表達(dá),抑制TD損傷的形成促進(jìn)TD損傷軟骨細(xì)胞功能的恢復(fù)

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